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目的:探索SUMO1及SENP1在骨肉瘤发生发展中的作用;明确SUMO1与SENP1在骨肉瘤细胞干性维持中的作用,以及对传统化疗敏感性的影响;以期为骨肉瘤的治疗尤其是对化疗不敏感的骨肉瘤干细胞的治疗提供一种新的治疗策略。方法:(1)(1)收集18例骨肉瘤患者标本,分别制备提取骨肉瘤组织与邻近肿瘤旁组织总蛋白,免疫蛋白印迹法检测SUMO家族成员SUMO1与SENP1在骨肉瘤组织中的表达;(2)免疫蛋白印迹法检测hFOB1.19及143B、MG-63和U-2OS中SUMO1及SENP1的表达;(3)CD133抗体标记143B细胞,流式细胞仪分选CD133~+细胞和CD133~-细胞后将CD133~+细胞和CD133~-细胞分别培养,检测SUMO1与SENP1蛋白表达差异;(4)使CD133~+骨肉瘤干细胞分别处于细胞周期的静止期、增殖期和衰老期,免疫印迹法检测不同细胞周期SUMO1及SENP1蛋白表达水平及干性维持相关基因Oct4、HIF-1α及PCNA蛋白表达水平。(2)(1)RNA干扰沉默CD133~+骨肉瘤干细胞中SUMO1表达,观察肿瘤干细胞克隆球形成能力,免疫荧光Ki67染色检测细胞增殖,流式细胞仪检测CD133~+群体比例及细胞周期,免疫荧光染色检测Ki67阳性率,transwell检测细胞迁移,检测4种与SUMO1相关已确认为其靶蛋白的蛋白PCNA、Oct4、HIF-1α、Akt1,两种迁移相关蛋白MMP2、MMP9以及凋亡相关蛋白Caspase-3;(2)慢病毒转导过表达SENP1观察骨肉瘤干细胞过表达SENP1后干性特征和功能,分析SENP1在骨肉瘤干细胞中的作用;(3)分别对骨肉瘤干细胞和非肿瘤干细胞进行tk、SENP1、tk+SENP1基因转导,更昔洛韦GCV治疗,体外观察细胞凋亡情况,分析SENP1在骨肉瘤干细胞对tk/GCV的体外敏感性;(4)构建皮下异种移植肿瘤模型,设置对照组、SENP1组、HSVtk/GCV组、联合组,分别观察肿瘤生长体积,肿瘤质量,TUNEL法测定原位细胞凋亡,免疫组化测定SUMO1、SENP1及PCNA蛋白表达。结果:(1)(1)骨肉瘤的新鲜肿瘤组织与邻近肿瘤旁组织相比处于结合状态SUMO1蛋白表达明显增高;肿瘤组织与肿瘤旁组织相比,SENP1表达约降低20%;(2)143B、MG-63、U-2OS相比hFOB1.19,结合状态SUMO1表达明显增高并且SENP1的表达显著性降低;(3)与CD133~-非肿瘤干细胞相比CD133~+肿瘤干细胞SUMO1表达较高,SENP1蛋白表达较低;(4)与增殖期或衰老期细胞相比,处于静止期的骨肉瘤干细胞SUMO1表达明显升高,SENP1蛋白表达水平较低及干性维持相关基因Oct4、HIF-1α表达明显较高及但增殖相关基因PCNA蛋白表达水平并未增高。(2)(1)siRNA干扰SUMO1后观察到肿瘤干细胞克隆球形态松散,出现大量贴壁,克隆球体积明显减小,细胞迁移明显减少,CD133~+群体比例明显降低,细胞周期多数由G0/G1期转变为S/G2期,细胞Ki67减少。PCNA、Oct4、HIF-1α、MMP2、MMP9、Caspase-3均降低,Akt1无降低;(2)过表达SENP1后观察到干细胞克隆球结构松散,可见周围碎片化,克隆球形成能力减低,细胞周期多数由G0/G1期向S/G2期转变,检测细胞Ki67表达降低。细胞迁移率仅微小变化,并且Ki67阳性率仅出现略微增加;PCNA、Oct4、MMP9、HIF-1α及Caspase-3蛋白的表达降低,但MMP2和Akt1蛋白表达无明显变化;(3)HSVtk/GCV明显增加贴壁细胞培养基中的LDH水平和凋亡细胞的比例,单独的SENP1对贴壁癌细胞和悬浮的骨肉瘤干细胞的细胞凋亡仅有轻微影响,与SENP1质粒组合时,骨肉瘤干细胞的细胞凋亡比例出现显著增加;(4)动物体内,单独SENP1未出现显著的肿瘤直径,体积,质量变化,TUNEL染色和凋亡细胞量也无明显变化,但降低了SUMO1和PCNA的表达水平。单独用HSVtk/GCV化疗方案治疗可在一定程度上减少上述指标,抑制肿瘤生长,然而又不能完全消除肿瘤。SENP1和HSVtk/GCV的联合应用进一步降低了肿瘤体积,质量并诱导了细胞凋亡。结论:(1)SUMO1在骨肉瘤中的表达明显升高,SENP1降低,骨肉瘤干细胞中升高更显著;(2)沉默SUMO1诱导骨肉瘤干细胞快速老化,抑制细胞增殖与迁移,并诱导细胞出现大量凋亡;(3)SENP1过表达显著降低干细胞干性维持能力,仅略微影响骨肉瘤干细胞迁移和凋亡;(4)过表达SENP1显著增加骨肉瘤干细胞对HSVtk/GCV的敏感性。