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新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是一种以鸭脾脏肿大、出血和坏死为主要特征的疫病。该病无明显发病周期,各种品系的鸭均能感染,可通过垂直、水平两种方式传播,自然状态下该病的发病率和死亡率相对较低,但鸭感染后会导致发育障碍和免疫抑制引起多种并发症,导致较高的死亡率,给我国水禽养殖业带来了极大的危害。本研究自四川隆昌地区患病鸭中分离得到一株呼肠孤病毒,将其命名为SL株,进而对其致病性进行研究;通过二代测序技术对SL株的全基因组进行测定,进而对其遗传进化关系进行分析;根据序列特征分别建立TaqMan和SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对2019-2021年期间山东、重庆、四川等10个省份不同养殖场共176份疑似临床样本进行检测,并与传统RT-PCR检测方法进行比较,对比三种方法的检出率,为NDRV的临床诊断及深入研究奠定基础。主要研究内容分为以下四个部分:1.新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性试验自四川隆昌脾坏死患病鸭中分离得到一株病毒,命名为SL株,鸭胚传代试验显示当传至F9代时,90%鸭胚死亡时间集中在60-120 h,胚体点状出血,脾脏和肝脏有坏死灶。经RT-PCR方法结合序列测定确定为鸭呼肠孤病毒。动物回归试验中感染鸭和死亡鸭均表现发育受阻,有角弓反张的症状,剖检发现肝脏有坏死灶,脾肿大梗死,散布出血点,与临床症状一致。病理组织学观察发现病鸭的肝、脾组织均有异嗜性粒细胞及淋巴细胞浸润,脾静脉有混合性血栓、红髓淤血。用F9代尿囊液10倍梯度稀释,取4个稀释度分别接种健康鸭胚,每组5枚,持续观察120 h,采用Reed-Muench法计算出病毒对鸭胚的半数致死量为10-5.32ELD50/0.2mL。取稀释后5个稀释度的F9代尿囊液接种5日龄健康雏鸭,每组10只,连续观察7d,获得该毒株对雏鸭的半数致死量为10-4.2ELD50/mL。2.新型鸭呼肠孤病毒SL株全基因组的测序和分析利用二代测序技术对SL株进行全基因组测序并对基因编码蛋白进行预测和功能注释,结果显示该毒株的全基因组共由10个节段组成,总长为23580 bp,GC含量为49.62%,分别编码λA（L1）,λB（L2）,λC（L3）,μA（M1）,μB（M2）,μNS（M3）,σA（S2）,σB（S3）,σNS（S4）,σC、P10、P17（S1）。将测序结果上传到NCBI数据库分别获得10个登录号:分别为S4-S1:MW196679-MW196682,M3-M1:MW196683-MW196685,L3-L1:MW196686-MW196688。对进行了功能注释的蛋白分析发现,除了μNS属于非结构蛋白以外,其他均属于结构蛋白,分别参与病毒复制的不同生物过程。对10个基因组片段进行比对分析,发现SL株与新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）具有较高的相似性（87.02%-99.48%）,与番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的相似性次之（80.09%-98.77%）,而与鸡源呼肠孤病毒（ARV）相似度最低（70.04%-91.15%）。系统进化树显示SL株的10个基因片段均位于NDRV与MDRV共同构成主干支中,而除了M1节段与MDRV（SH12）位于同一分支,L1节段与MDRV和NDRV位于同一分支且与XT18和GX-Y7距离最近以外,其他的所有基因节段都与NDRV（GX-Y7,XT18）位于同一分支且距离最近,由此推断SL株可能是MDRV和NDRV发生基因重组的结果,说明本试验分离的SL病毒株为一种新型鸭呼肠孤病毒。3.新型鸭呼肠孤病毒荧光定量PCR检测方法的建立根据新型鸭呼肠孤病毒SL株S1基因设计合成一对引物,构建阳性质粒标准品,而后设计合成一对特异性引物和一条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR Green Ⅰ两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较。结果显示,两种检测方法标准曲线的相关系数均为0.999,对鸭细小病毒（DPV）、Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-1）、Ⅲ型鸭肝炎病毒（DHV-3）、鸭传染性支气管炎（IBV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鹅星状病毒（GAst V）的检测结果均为阴性,特异性良好。SYBR Green Ⅰ法的最低检测限度为10~0copies/μL,TaqMan法的最低检测限度为10~1copies/μL,前者的灵敏度较高。SYBR Green Ⅰ法和TaqMan法重复性试验的组内和组间变异系数分别小于2.1%和1.8%。综上,两种荧光定量方法均成功建立,其中尤以SYBR Green Ⅰ法灵敏度更高。4.新型鸭呼肠孤病毒荧光定量检测方法在临床中的应用及比较利用TaqMan、SYBR Green Ⅰ两种检测方法对176份病料进行检测,同时与RT-PCR检测方法进行比较,结果显示,SYBR Green Ⅰ法检出146份阳性,检出率为83%,TaqMan探针法检出152份阳性,检出率为86%,传统RT-PCR检测方法的阳性个数为107,检出率为61%。利用卡方检验对两种荧光定量检测方法的检出率进行统计学数据分析,结果显示P值=0.37＞0.05,说明两种检测方法的检出率差异不显著,但均高于普通RT-PCR方法。