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大黄鱼(Larimichthys crocea,L.crocea)是我国特有的重要海洋经济鱼类之一。但是由于大量捕捞,其野生种群数量急剧减少,而养殖的大黄鱼随着养殖密度的增加和养殖规模的扩大,其种群多样性下降,种群的免疫抵抗能力也相应降低,因此容易受到各种病原体的侵害,给水产养殖业带来严重的损失。Toll样受体(toll-like receptor,TLR)能够识别各种病原体,不仅参与先天免疫,也参与获得性免疫。本文主要研究大黄鱼toll样受体5(lcTLR5)及其家族基因和toll样受体信号通路中重要基因在大黄鱼免疫系统中的作用,从而进一步认识鱼类生理及病理过程,同时为海洋鱼类养殖某些疾病的防治和诊断提供基础资料及新的思路。本研究从基因和蛋白质水平研究大黄鱼toll样受体信号通路重要基因(TLR5M、TLR13、TAK1、TAB1-3、IL12A、IL16和IL34)的免疫功能。研究内容主要是目的基因的分子特征分析、转录本表达分析,以及大黄鱼TAB1-3和TAK1蛋白功能研究。研究方法及结果如下:⒈分子特征分析。二次检索从实验室的大黄鱼基因库下载得到目的基因的DNA序列,之后利用ORF finder等在线软件预测目的基因的编码序列(coding sequence,CDS),从而翻译获得氨基酸序列。通过分析氨基酸序列,获得目的基因的功能域结构、三维结构、多序列比对情况,以及它们与同源基因之间的进化关系。由此发现目的基因的功能域结构和特殊基序与它们在其他物种中的同源基因保守,间接证明了大黄鱼的这些基因具有免疫功能。⒉转录本表达分析。用CDS预测前后引物,用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测目的基因转录本的表达量。荧光定量检测的模板是从健康大黄鱼组织(脾、肝、肾、心脏、肌肉、肠、鳃、皮肤、脑和鱼鳍)和大黄鱼腹腔注射病原体(弧菌或poly I:C)后(时间梯度:0h,6h,12h,24h,48h,72h和96h)的组织(脾、肝、肾)中提取的总RNA逆转录得到的cDNA。健康大黄鱼免疫组织更容易高表达目的基因,而且病原体侵染能够引起目的基因的RNA表达水平的上调,证明目的基因在大黄鱼免疫系统中发挥作用。⒊蛋白在通路信号转导中的功能研究。过表达大黄鱼TAB1、TAB2、TAB3和TAK1(lcTAB1、lcTAB2、lcTAB3和lcTAK1),然后通过免疫荧光染色(immunofluorescence staining,IMC staining)确定目的基因能否正常表达,了解目的蛋白的亚细胞定位情况,以及检测下游NF-κB的蛋白水平;同时,从提取总蛋白,通过Western blot检测LPS对lcTAB1-3和lcTAK1蛋白水平的影响,以及lcTAB1-3和lcTAK1过表达对NF-κB的蛋白水平的影响。最后进行Co-IP实验,用于了解lcTAB1-3与lcTAK1之间的互作关系。亚细胞定位结果显示,lcTAK1和lcTAB1蛋白主要在胞质溶胶中表达,lcTAB2和lcTAB3定位在内涵体中。IMC staining和Western blot的结果证明,当lcTAB1-3和lcTAK1同时过表达时,下游NF-κB的蛋白水平明显上调,证明lcTAB1-3和lcTAK1作用,影响通路的信号传导。免疫共沉淀(Co-IP)实验进一步了lcTAB1-3均能跟lcTAK1直接作用。综上所述,对大黄鱼TLR5、TLR13、TAK1,TAB1-3、IL12A、IL16和IL34的分子特征分析间接这些基因具有与哺乳动物中同源基因相似的免疫功能;对健康大黄鱼和攻毒后的大黄鱼中目的基因的转录本水平定量检测,结果显示这些基因容易在脾、肝和肾等免疫器官中高表达,而且免疫刺激后所有基因的转录本水平均被上调,进一步断定这些基因在大黄鱼免疫体系中发挥作用;对lcTAB1-3和lcTAK1蛋白产物在通路中的功能研究证明TAB1-3与TAK1结合,影响通路的信号传导,最终引起NF-κB的激活。我们的研究确定了大黄鱼TLR通路中几类关键基因的免疫功能,并且初步确定lcTAB1-3和lcTAK1在大黄鱼TLR信号通路的功能。