烟嘧磺隆作为一种广谱、高效的磺酰脲类除草剂，因其具有防效好、用量低、对作物安全等优点被广泛用于玉米田杂草的防除。但与此同时，由于其长期大量使用所引起的一系列环境问题也日益凸显，诸如对后茬作物的残留药害、对土壤及周边水生生态系统的潜在污染等。因此，采用高效合理的方法将其对环境所产生的负面影响降到最低，已成为目前亟待解决的问题。相关研究表明，微生物修复因其安全、高效、成本低、对环境友好等特点，己成为目前解决磺酰脲类除草剂在环境中残留的重要手段之一。
　　1.本研究以赤子爱胜蚯蚓（Eisenia fetida）肠道作为研究材料，通过分离筛选得到一株对烟嘧磺隆具有高效降解作用的菌株，命名为CF57。经菌落形态、生理生化、16S rRNA基因序列分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。
　　2.采用单因素试验及响应面法对菌株CF57的最适降解条件进行研究，结果表明，该菌在基础培养基Ⅲ中的最适降解条件为温度30.80C、pH6.31和接种量3.04％。菌株CF57在该条件下连续培养5d，对初始浓度为100～300mg/L烟嘧磺隆的降解率可达到90％以上。此外，该菌可耐受并降解初始浓度高达500mg/L的烟嘧磺隆，并对供试的苯磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、苄嘧磺隆和醚磺隆6种磺酰脲类除草剂表现出良好的降解效果。运用LC/MS对菌株CF57降解烟嘧磺隆所产生的代谢产物进行检测，主要获得2种代谢产物，推断其可能的代谢途径为烟嘧磺隆磺酰脲桥C-N键的断裂。
　　3.通过降解酶定域试验发现，菌株CF57对烟嘧磺隆具有降解作用的酶主要来源于胞外酶。运用丙酮沉淀法、DEAE-FF阴离子交换层析柱法及PAGE法对胞外酶进行分离，共得到10个活性组分。结合水解圈法和酶液反应体系法对所分离组分进行活性检测，并选择活性较高的P3-4、P4-2和P4-4分离组分进行质谱鉴定。经序列比对得知这3个组分分别为糖磷酸异构酶(Sugar phosphate isomerase)、亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase)和精氨酸酶(Arginase)。
　　4.根据糖磷酸异构酶、亮氨酸氨基肽酶和精氨酸酶的编码基因序列，利用原核表达的方式获得了3种降解酶的可溶性酶液。采用活性检测方法对其酶学特性进行研究，结果表明，3种降解酶在不同温度和pH条件下均表现出良好的稳定性，而且均能够在较广的温度范围和pH值范围内有效降解烟嘧磺隆。其中，糖磷酸异构酶的最适降解条件为温度35℃、pH7.0，亮氨酸氨基肽酶和精氨酸酶的最佳降解条件为温度40℃、pH7.5。通过在溶液中添加Fe2+、K+、Mn2+和Ca2+可有效促进糖磷酸异构酶对烟嘧磺隆的降解作用，Cu2+和Mn2+则可分别提高亮氨酸氨基肽酶和精氨酸酶对烟嘧磺隆的降解酶活。此外，这3种降解酶都能够有效降解多种磺酰脲类除草剂，并且均对烟嘧磺隆和苯磺隆表现出较高的降解活性。采用LC/MS对3种酶降解烟嘧磺隆的代谢产物进行检测，发现3种酶降解烟嘧磺隆的代谢产物与菌株CF57降解烟嘧磺隆所产生的代谢产物相一致，该结果进一步表明了菌株CF57对烟嘧磺隆的降解作用主要是通过降解酶的参与。
　　5.为进一步获得性质优良的烟嘧磺隆降解酶，本文结合计算机模拟和定点突变对亮氨酸氨基肽酶及精氨酸酶进行了酶分子改造，并采用活性检测方法对突变前后酶活性进行了比较分析。结果发现，相比于野生型，亮氨酸氨基肽酶所有突变体活性均下降，其中突变体K86P完全失去了对烟嘧磺隆的降解活性。因此，推断K86可能为亮氨酸氨基肽酶催化降解烟嘧磺隆的关键活性位点。在精氨酸酶突变体中，得到N135K和S174L两株活性提高的突变体酶，其酶比活分别为野生型的1.23倍和1.08倍。通过比较突变体N135K和S174L与野生型的Km值，发现两株突变体酶的Km值均小于野生型精氨酸酶的Km值。因此，推测这两株突变体酶活性升高的原因很可能是由于氨基酸的改变增强了精氨酸酶与烟嘧磺隆的亲和力。
　　综上所述，本研究初步揭示了贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CF57对烟嘧磺隆的降解作用及作用机理，并对所得到的3种新的烟嘧磺隆降解酶的酶学特性及代谢途径进行了分析，不仅丰富了磺酰脲类除草剂的降解菌和降解酶资源，而且为今后菌制剂和酶制剂的开发应用及降解酶的工业化生产奠定了理论基础，同时，本研究结合计算机模拟和定点突变技术对亮氨酸氨基肽酶及精氨酸酶进行了酶分子改造，推断了酶催化降解烟嘧磺隆的关键活性位点并获得两株活性优良的突变体酶，为今后深入探究酶与小分子的相互作用及获取更多性质优良的磺酰脲类除草剂降解酶提供了理论支持。