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三氯蔗糖是一种甜度高、无热量的甜味剂,具有优良的生理功能,单酯法是合成三氯蔗糖的主要方法,蔗糖-6-乙酯是单酯法合成三氯蔗糖的关键中间体。酶法合成蔗糖-6-乙酯具有区域选择性好、反应条件温和、对环境友好等优点,是当前的研究热点。本文以固定化黑曲霉脂肪酶和固定化疏棉状噬热丝孢菌脂肪酶(TLIM酶)为催化剂,催化合成蔗糖-6-乙酯,通过对合成工艺的优化来提高酯化率和6位选择率。并通过表面活性剂包衣技术或生物印迹技术等酶改性技术来提高酶的催化活性,获得了具有更好催化活性的包衣固定化疏棉状噬热丝孢菌脂肪酶和固定化印迹黑曲霉脂肪酶。(1)本研究筛选出固定化黑曲霉脂肪酶作为催化剂,确定了适合于固定化黑曲霉脂肪酶的反应体系,并优化了其催化合成蔗糖-6-乙酯的合成工艺。发现叔戊醇与二甲基亚砜配比为5:1的混合有机相是最为合适的反应体系,在最适合成条件下,使用固定化黑曲霉脂肪酶催化蔗糖-6-乙酯合成,酯化率最高可达72.6%,6位选择率可达83.6%;固定化疏棉状噬热丝孢菌脂肪酶(TLIM酶)在最适条件下催化蔗糖-6-乙酯合成,酯化率为酯化率可达80.1%,6位选择率为87.4%。还发现放大反应体系至100mL,反应进程稳定,反应结果与小试结果基本一致。(2)本研究将表面活性剂包衣技术和酶固定化技术结合,选用表面活性剂对固定化疏棉状噬热丝孢菌脂肪酶(TLIM酶)和固定化黑曲霉脂肪酶进行包衣,并优化了包衣工艺。发现包衣TLIM酶的催化活力得到提升,包衣固定化黑曲霉脂肪酶的催化活力下降。使用司盘85包衣TLIM酶,其活性提升最大。在最适包衣条件下,包衣TLIM酶的酯化活性与未包衣TLIM酶相比最多提高了0.5倍。(3)本研究将生物印迹技术和酶固定化技术结合,先使用印迹分子对酶进行印迹,再进行固定化,并对印迹条件进行探索。在最适印迹条件制作得到的固定化印迹酶催化合成蔗糖-6-乙酯,酯化率最高可达82.4%,6位选择率为82.5%,相比未印迹的固定化黑曲霉脂肪酶,酯化活性提高了0.2倍。固定化印迹酶与TLIM酶在混合有机相中的操作稳定性表现基本一致。