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生物被膜(biofilm)被定义为微生物黏附于固体表面并嵌入于自身分泌的胞外聚合物基质(Extracellular Polymeric Substances,EPS)所构成的微生物群落结构。该基质为内部细胞提供了保护作用,并有助于微生物吸收养分及粘附表面。生物被膜形成是一种社会行为,细胞通过分泌小信号分子来调节细胞密度的变化,并通过负责初始黏附靶位点、生物被膜的生长和成熟的细胞功能的表达来做出反馈调节。在食品工业中,食品表面和设备表面(食品接触和非食品接触)容易形成生物被膜,腐败菌或病原菌生物被膜的形成能加速食品的腐败、增大设备损耗及导致食品安全问题,降低了食品品质和食品安全性。并且,在大多数情况下由两种或多种微生物混合存在,不同菌种之间存在的相互关系不同,形成的混合生物被膜特性也不同,因此不可以使用同一套控制策略,这对食品工业带来了极大的挑战和负担。因此研究混合生物被膜势在必行。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是常见的水产源致病菌,人类感染了致病性的副溶血性弧菌后容易导致急性肠胃炎,甚至休克死亡。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌,广泛存在于各类食品种,人和动物感染后可导致脑膜炎、败血症,孕妇流产、死胎等疾病,发病者病死率高达30%～70%。中国的多项监测报告显示,中国沿海地区市售的水产品及市售冷冻鱼糜制品中能同时检测出高检出率副溶血性弧菌和较低检出率单增李斯特菌,这说明研究水产品中副溶血性弧菌的同时,单增李斯特菌也不可忽略。本研究主要以副溶血性弧菌(标准菌株ATCC17802和三文鱼中的分离菌株VP24)和单增李斯特菌(标准菌株ATCC19115和三文鱼中的分离菌株LM5)为研究对象,研究其非生物表面混合生物被膜的形成特性以及两种细菌间的相互关系。本研究能对未来制定预防水产品微生物源食品安全问题的策略提供理论参考。本文主要研究内容及研究结果如下:1.副溶血性弧菌和单增李斯特菌在冷藏温度(4℃)、常温(25℃)和人体温度(37℃)下的单、混合生物被膜形成本研究采用结晶紫染色法、q PCR绝对定量法、激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)和XTT还原法分析不同温度环境下形成单、混合生物被膜的能力、被膜中细胞数量的变化及被膜活性的差异。结果发现,单、混合生物被膜成熟的快慢受温度影响如下:37℃>25℃>4℃(副溶血性弧菌);25℃>37℃>4℃(单增李斯特菌);37℃>25℃>4℃(混合生物被膜)。当两物种混合培养形成混合生物被膜时,在25℃和37℃下均表现出混合生物被膜生物量减少,代谢活性降低,并且在成熟的混合生物被膜中副溶血性弧菌的活细胞数比单增李斯特菌活细胞数多出10~2倍。但是在4℃下,混合生物被膜形成与单增李斯特单物种生物被膜有类似的趋势。2.常温下副溶血性弧菌-单增李斯特菌混合生物被膜的结构特性及被膜基因表达本研究采用CLSM法(ISA-2软件分析)、荧光原为杂交(FISH)、扫描电镜(SEM)、RT-q PCR、Raman光谱分析和化学分析法研究常温下混合生物被膜的结构特点和相关基因表达分析。结构参数结果显示,相对于单物种生物被膜,混合生物被膜的生物体积减小约2倍,平均厚度低于单物种生物被膜的1/2,孔隙率增大约30%。通过荧光原位杂交观察到,在混合生物被膜中,大部分副溶血性弧菌能覆盖在单增李斯特菌上方,且由副溶血性弧菌形成的生物被膜体积比单增李斯特菌的多大约4х10~5μm~3,胞外多糖和蛋白显著减少;在副溶血性弧菌中被膜形成的相关基因aph A,opa R,oxy R基因表达下调,msh A无显著差异,单增李斯特菌的fla E,mot B,deg U,fla A基因显著下调。说明两菌共存时存在竞争相互关系,不利于混合生物被膜的形成,并且副溶血性弧菌对混合生物被膜的贡献率较大。3.单增李斯特菌上清培养液对副溶血性弧菌的生物被膜形成及细胞增殖的影响本研究采用结晶紫染色法、Biosreen测生长曲线、CLSM法、扫描电镜(SEM)、XTT还原法和RT-q PCR研究上清培养物中单增李斯特菌代谢物对副溶血性弧菌生物被膜形成及细胞增殖的影响。通过采用单增李斯特菌和副溶血性弧菌上清培养液对两细菌进行独立互养生物被膜,结果发现,单增李斯特菌的上清培养液有利于副溶血性弧菌生物被膜形成和细胞增殖,表现在副溶血性弧菌生物被膜生物量的显著增多、代谢活性增强,被膜孔隙率非常小,最大比生长速率增大,群体感应基因msh A基因上调25倍,伴有aph A、Opa R基因略微下调;而副溶血性弧菌上清培养液液却抑制单增李斯特菌生物被膜的形成。