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鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳属(Eimeria)球虫引起的一种严重危害鸡生长发育的寄生原虫病。该病呈世界性分布,难于防治。迄今公认的鸡艾美耳球虫病的病原有9种,其中柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)为致病力最强的球虫之一。目前防治球虫病的手段主要依赖于药物,但药物耐药性的产生、研制新药费用之高以及人们对药物残留的日益关注和环境保护意识的增强,使鸡球虫病的防治处在一个十分无奈和尴尬的境地,’人们迫切期望找到一种更好的防治手段来取代药物治疗。本研究选择了在禽类艾美耳球虫各虫种间保守性较高的柔嫩艾美耳球虫3-1E基因,应用DNA重组技术将该基因分别克隆入原核表达载体pET-32a(+)和真核表达载体pcDNA3.1(+)中,而且在真核表达质粒中3-1E基因下游插入在抗球虫免疫中发挥重要作用具有较好佐剂效果的鸡IFN-γ基因和鸡IL-2基因。并用重组抗原和真核重组DNA质粒分别免疫动物,观察其诱导产生的特异性免疫应答反应,探讨其作用机制,并通过对鸡只攻击E.tenella的保护作用检测其抗球虫效果。研究结果显示：1.构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-3-1E,经过酶切鉴定,在DNA Marker 6000bp及500bp处有明显条带,与理论中pET-32a(+)载体5900bp及3-1E基因513bp相一致；PCR鉴定表明用3-1E基因特异性引物可以在DNA Marker 500bp处扩增得到一明显条带,与理论中3-1E基因513bp相一致；委托生物公司进行序列测定也显示序列正确且未发生突变。由此表明pET-32a(+)-3-1E质粒构建成功。2.将质粒pET-32a(+)-3-1E转化Rosetta感受态细胞并进行了原核表达。对表达蛋白的可溶性、诱导表达时间及诱导剂IPTG的浓度进行优化表明在IPTG浓度为0.8mmol/L诱导6h时表达量最大,所表达重组蛋白为可溶性蛋白。将重组蛋白进行western-blot试验,可以与感染柔嫩艾美耳球虫的鸡阳性血清发生特异性反应。3.对鸡只肌肉接种重组3-1E蛋白进行免疫保护试验,并同时设立重组蛋白+弗氏完全佐剂(FCA)对照组、百球清药物对照组、不免疫攻虫对照组(红组)、不免疫不攻虫对照组(白组)。结果显示,重组3-1E蛋白能够不同程度提高血清IgG、IL-4、IFN-γ的水平,但对脾脏T淋巴细胞增殖功能的作用较小,而所有指标在加入弗氏完全佐剂(FCA)的对照组中有小幅度的提高。重组3-1E蛋白与加入弗氏完全佐剂的重组3-1E蛋白的抗球虫指数(ACI)分别为171.45、174.92,具有中等抗球虫效果。4.构建重组真核表达质粒,将E.tenella 3-1E基因与鸡IFN-γ基因、鸡IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E-IFN-γ、pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2,同时构建对照质粒pcDNA3.1(+)-3-1E、pcDNA3.1(+)-IFN-γ、pcDNA3.1(+)-IL-2。经过酶切鉴定、PCR鉴定,其结果均与理论中pcDNA3.1(+)载体5428bp、3.1E基因513bp、鸡IFN-γ基因495bp及鸡IL-2基因429bp相一致；委托生物公司对序列进行测定后结果也与预期序列一致,未发生突变。证明上述各质粒构建成功。5.将构建成功的质粒pcDNA3.1(+)-3-1E-IFN-γ及pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2免疫鸡只,检测其在鸡体内基因转录及表达的情况。通过RT-PCR检测基因转录情况可得到预期大小的条带,通过western-blot试验检测基因表达情况也可得到预期大小的特异性条带。证明质粒pcDNA3.1(+)-3-1E-IFN-γ及pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2在鸡体内均可正常工作。6.将真核表达质粒免疫雏鸡进行免疫保护试验,其结果表明,pcDNA3.1(+)-3-1E-IFN-γ、pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2均能明显地提高血清IgG、IL-4、IFN-γ的水平,在脾脏T淋巴细胞增殖功能方面有较大的增强作用,而以pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2效果最佳。从抗球虫指数(ACI)来看,pcDNA3.1(+)-3-1E-IFN-γ、pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2分别为181.04、187.30,具有有效地抗球虫效果。本试验将柔嫩艾美耳球虫重组3-1E基因作为保护性基因,构建了原核表达质粒及真核表达质粒,并在将原核表达蛋白及真核表达质粒研制成抗球虫疫苗的方面迈出了第一步,证明了试验中所得原核蛋白作为抗球虫疫苗具有中等抗球虫效果,真核表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E-IFN-γ及pcDNA3.1(+)-3-1E-IL-2作为DNA疫苗具有高效的抗球虫效果,为将其最终应用到实际当中奠定了基础。