干扰素是一类能够广泛表达于多种单核细胞如巨噬细胞、树突状细胞及成纤维细胞等,具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种功能的细胞因子,1994年首次克隆出鸡α干扰素以来,鸡α干扰素抗病毒活性的功能在兽医学领域得到极大的重视。鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC具有独特的结构和功能,可刺激机体产生某些炎性因子,在天然免疫及适应性免疫中作为有效激活剂,发挥重要作用,鞭毛蛋白在原核表达系统中呈可溶性表达,作为基础的疫苗佐剂已被广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等病原体疫苗的研制,在兽医临床均有较好的效果。原核表达系统成本低、蛋白表达产量高,是一种获得目的蛋白有效的方法,但鸡α干扰素在原核表达系统中以包涵体形式存在,而难以在临床中广泛应用。本文旨在通过原核表达系统构建一种使鸡α干扰素可溶性表达的融合蛋白,该蛋白既具有鸡α干扰素抗病毒活性这一功能,又具有鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC免疫调节这一功能,从而为鸡α干扰素在临床上的应用提供技术基础。本研究通过构建原核表达鸡α干扰素质粒pET28a-Chifn及鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC质粒pET28a-FliC,并将基因Chifn及fliC连接构建原核表达鸡α干扰素与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白质粒pET28a-EcBoc,将三种质粒分别转化至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析三种蛋白表达情况。经过分析,获得表达产物大小为72 KDa左右的融合蛋白EcBoc,且蛋白呈可溶性表达,主要表达在上清;同样表达条件下,获得表达产物大小为18 KDa左右的鸡α干扰素蛋白,主要以不可溶性包涵体存在;获得表达产物大小为54 KDa左右的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因FliC蛋白,主要呈可溶性表达。经过条件优化,经Ni柱层析树脂纯化表达产物后,获得纯度较高的融合蛋白EcBoc。为验证融合蛋白EcBoc各方面的功能,首先,构建含有Mx蛋白启动子Mx-promoter的双荧光素酶质粒pGL3 basic Mxp,通过双荧光素酶报告基因系统检测目的蛋白是否能激活Mx蛋白的启动子;另外,构建绿色荧光蛋白质粒pGL3 basic Mxp-EGFP,通过荧光显微镜更为直观地观察已转染质粒pGL3 basic Mxp-EGFP的DF1细胞,孵育过蛋白EcBoc后,绿色荧光发光情况,判断该蛋白激活Mx蛋白启动子的情况;另一方面,通过将质粒pGL3 basic Mxp-EGFP转染至DF1细胞,转染后孵育融合蛋白EcBoc,采取流式细胞术分析DF1荧光细胞比例,定量分析该蛋白激活Mx启动子的情况。最后,通过酶联免疫吸附试验,检测融合蛋白EcBoc刺激PBMC细胞产生TNF-α情况来分析该蛋白是否具有鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的活性及功能。结果显示,通过双荧光素酶报告基因系统验证了融合蛋白EcBoc能够激活Mx蛋白的启动子,具有鸡α干扰素蛋白生物学活性;通过荧光显微镜观察到,已转染质粒的DF1细胞,孵育过融合蛋白后,发光明显;通过流式细胞术分析实验组孵育10 ng/μL的融合蛋白EcBoc,DF1荧光细胞比例达到24.30%,鸡α干扰素组中的DF1荧光细胞比例为29.68%,和空白对照组相比,差异显著（P＜0.01）,从而验证了融合蛋白EcBoc具有鸡α干扰素功能。另外,通过ELISA方法检测到融合蛋白EcBoc能够刺激PBMC细胞产生TNF-α,且浓度达到54.68 pg/m L,和对照组相比,差异显著（P＜0.01）,从而验证了融合蛋白EcBoc具有鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的活性及其功能。综上所述,本论文成功将鸡α干扰素与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC融合,构建了一种在原核系统中可溶性表达的鸡α干扰素融合蛋白,该融合蛋白既具有鸡α干扰素抗病毒活性这一功能,又具有鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白免疫调节这一功能。