血栓性疾病严重危害人类健康,而传统抗凝药又存在许多局限。新一代抗凝药的研发成为全球抗凝药研究的热点。现代研究表明显著抑制活化的凝血因子Xa(FXa)可有效抗凝而不影响基本的止血,这使FXa抑制剂成为理想的抗凝药物。抑制FXa的新结构类型活性化合物的发现对新一代抗凝药的研究至关重要。活血化瘀类中药用于治疗血瘀证具有悠久的历史,现代药理研究也表明,部分活血化瘀中药具有一定的抗凝活性。课题组前期对常用活血化瘀药抑制FXa的活性进行了筛选,结果显示王不留行、桃仁和郁金85%醇提取物对FXa具有较好的抑制活性。本文对这三种中药抑制FXa的活性部位进行了分离纯化,以期找到活性成分,为研发具有自主知识产权的新颖抗凝药物提供科学依据,奠定物质基础。主要研究内容如下：1.中药王不留行中抑制FXa活性成分研究利用各种柱色谱技术从王不留行抑制FXa的活性部位中分离纯化了13个化合物,利用1H-NMR、13C-NMR、MS、BC、DEPT等波谱技术分别鉴定为α-波甾醇、豆甾-7,22-二烯-3-酮、豆甾-1,5-二烯-3-醇、N-(3-甲氧基-4-羟基苯乙基)正二十四烷酸酰胺、N-(3,4-二羟基苯乙基)正二十四烷酸酰胺、丝石竹酸、16-羟基丝石竹酸、原儿茶酸、王不留行环肽A、王不留行环肽B、腺苷、牡蛎素和pinnatifin E,其中化合物N-(3-甲氧基-4-羟基苯乙基)正二十四烷酸酰胺、N-(3,4-二羟基苯乙基)正二十四烷酸酰胺和pinnatifin E为3个新化合物。对各单体化合物进行了FXa抑制率测定,IC50分别为279.55,286.98,307.54,210.57,222.67,165.23,293.67,654.65,198.18,249.30,380.71,221.83,278.17μmol/L,其中化合物丝石竹酸和王不留行环肽A对FXa具有一定的抑制活性。2.中药桃仁中抑制FXa活性成分研究利用各种柱色谱技术从桃仁抑制FXa的活性部位中分离纯化了10个化合物,利用1H-NMR、13C-NMR、MS等波谱技术分别鉴定为9-十八碳烯酸-2’,3’-二羟基丙酯、胡萝卜苷、扁桃酰胺、苯甲酸、2-羟基-9-十八碳烯酸、正十七烷酸、9-十八碳烯酸甲酯、对羟基苯甲酸、正十六烷酸、苦杏仁苷。对各单体化合物进行了FXa抑制率测定,ICso分别为265.80,187.25,565.46,850.54,454.06,303.52,440.56,691.75,373.58,220.12μumol/L,其中化合物胡萝卜苷具有一定的FXa抑制活性。3.中药郁金中抑制FXa活性成分研究利用各种柱色谱技术从郁金抑制FXa的活性部位中分离纯化了10个化合物,利用1H-NMR、13C-NMR、MS等波谱技术分别鉴定为桂莪术内酯、a-epoxide、正十六烷酸、邻苯二甲酸二丁酯、莪术烯醇、二十二烷醇、甘油三亚油酸酯、β-谷甾醇、5-羟甲基-糠醛、双[5-甲酰基糠基]醚。对各单体化合物进行了FXa抑制率测定,IC50分别为287.31,233.78,303.55,376.83,402.31,301.20,202.39,255.90,173.61,166.88μmol/L其中化合物5-羟甲基-糠醛和双[5-甲酰基糠基]醚具有一定的FXa抑制活性。4.FXa抑制剂-甘草次酸与天然抗血小板聚集活性成分的协同抗凝血作用研究体外采用试剂盒法测定了FXa抑制剂甘草次酸与天然抗血小板聚集活性成分对APTT、TT的延长作用,按Berenbaum法公式评价两药合用时效应,其中甘草次酸和川芎嗪合用时Y值小于1,表明甘草次酸与川芎嗪体外具有协同抗凝作用。体内采用玻片法证明甘草次酸与川芎嗪联合用药比单用显著延长大鼠凝血时间,断尾法证明甘草次酸和川芎嗪联合用药不显著延长大鼠出血时间,不会引起体内大出血。因此,甘草次酸和川芎嗪联合用药能增强彼此的抗凝作用且不会增加出血风险。综上,本文研究了王不留行、桃仁和郁金的FXa抑制活性,对主要活性部位进行了分离纯化,结果发现化合物丝石竹酸、王不留行环肽A、胡萝卜苷、5-羟甲基-糠醛和双[5-甲酰基糠基]醚对FXa具有一定的抑制活性。并对FXa抑制剂甘草次酸与抗血小板聚集药物的协同抗凝作用进行了研究,发现甘草次酸与川芎嗪联合用药可显著延长APTT、TT时间及大鼠凝血时间,表明甘草次酸与川芎嗪联合用药体外体内均具有协同抗凝作用,且不会引起体内大出血。虽然这些化合物的活性与已上市药物相比较弱,但它们不同的结构类型也可为FXa抑制剂的研究提供了新的启示。