背景:人多能干细胞具有自我更新能力和分化为成体任何一种细胞的潜能,因此通过诱导多能干细胞的定向分化可以在体外大量获得具有疾病治疗价值的功能细胞。人多能干细胞衍生的神经干细胞和特定功能神经元在神经系统疾病的细胞治疗中有重要的应用价值。目的:脑缺血是一种高致残率和高致死率的疾病,在损伤部位会出现神经元的死亡,且这种细胞的死亡是不可逆的。目前,临床上尚缺少有效的治疗药物。人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,h ESCs)是一种多能干细胞,其可在体外稳定自我更新并能够分化成多种类型成体细胞,本课题拟将h ESCs体外定向分化为前脑神经干细胞(Forebrain neural stem cells,FNSCs),再通过体内细胞移植,初步探索FNSCs移植治疗对脑缺血小鼠运动功能的影响。方法:1.体外实验:运用化学生物学方法诱导h ESCs定向分化为可自我更新的FNSCs,进一步将FNSCs分化成前脑神经元;运用免疫荧光染色技术进行相关标志物的表达鉴定。利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因编辑技术构建FOXG1基因敲除的h ESCs细胞系以探索其对前脑分化的影响。2.体内实验:将成年严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠随机分为假手术组、模型组、细胞移植组。采用大脑中动脉栓塞(MCAO)法构建脑缺血模型。脑缺血7天后,将GFP标记的FNSCs注射到细胞移植组小鼠的脑室内,模型组注射等量的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)。5周后,行为学检测评估FNSCs移植对脑缺血小鼠运动功能的影响,运用免疫荧光染色技术观察移植的FNSCs在体内的存活及分化情况。结果:1.免疫荧光染色等结果显示,在化学成分明确的分化条件下,h ESCs分化为稳定自我更新的FNSCs,细胞表达前脑标志分子FOXG1和OTX2,神经干细胞标志分子NESTIN,SOX2和PAX6,和细胞增殖抗原Ki-67。2.该前脑神经干细胞可自发分化为皮层神经元,表达TBR1、BRN2等皮层神经元的标志分子,以及成熟神经元的标志NEUN。3.利用CRISPR/Cas9技术构建了FOXG1基因敲除的h ESCs细胞系。免疫荧光染色及定量PCR结果显示,FOXG1基因片段的缺失并不影响h ESCs分化为前脑神经干细胞。4.通过体内移植FNSCs,我们发现细胞移植组小鼠的运动功能较模型组有明显有改善。免疫荧光染色结果提示,移植的FNSCs可在体内存活并分化为TUJ1~+神经元。结论:1.成功将h ESCs诱导分化为FNSCs,该细胞系可以在体外稳定自我更新,并可进一步分化为前脑皮层神经元。2.在早期h ESCs神经诱导过程中,FOXG1并不是调控前脑神经分化的关键基因。3.FNSCs的体内移植促进了小鼠脑缺血损伤后的运动功能修复。