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研究背景癫痫是中枢神经系统的常见病及多发病之一,以反复自发地癫痫发作为特征,引起一系列躯体及社会心理问题。其中,颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是局灶性癫痫中最常见的类型,也是难治性癫痫中最常见的综合征类型。TLE作为一种复杂性疾病,受环境与遗传因素的共同影响。遗传变异通过影响痫样放电的易感性、临床内表型特异性及抗癫痫药物的反应性及耐药性等多个方面在TLE发生、发展及预后中发挥重要的作用。候选基因关联研究发现了某些神经系统特异基因上的常见变异与TLE的发生相关,但研究结果不尽一致。本文应用病例对照的研究方法,以5-羟色胺转运体(serotonin transporter,5-HTT)基因、大电导钙离子激活钾离子通道M亚家族β4亚基(potassium large conductance calcium-activated channel, subfamily M, beta memeber, KCNMB4)基因、肉碱/γ-氨基丁酸转运体1(betaine/GABA transporter-1, BGT-1or SLC6A12)基因、脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor, BDNF)基因为候选基因,分析基因多态性与中国汉族人群TLE的相关性,并对部分阳性位点在mRNA、蛋白水平及脑影像学三个方面进行功能验证。研究方法以中国汉族人群TLE患者和非癫痫对照受试者为研究对象,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法、TaqMan(?)法检测5-HTT、KCNMB4、SLC6A12及BDNF基因上常见多态性。分析这些位点及构成的单倍型与TLE的相关性,并探讨基因型-表型关系。应用实时定量PCR (real-time PCR)法检测阳性位点对外周血单核细胞SLC6A12基因表达的影响。应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测阳性位点对血浆BDNF含量的影响。应用头颅核磁共振(MRI)体素形态学分析(voxel-based morphometry, VBM)法检测BDNF上阳性位点对海马体积及海马对称性的影响。研究结果1.5-HTT基因多态性与TLE的相关性在334例TLE患者和487例非癫痫对照受试者中,检测5-HTT基因功能区的3个多态性位点(5-HTTLPR, rs25531,5-HTTVNTR),发现5-HTTVNTR位点的10次重复等位基因在TLE组的频率高于对照组频率(9.1%vs.6.1%, P=0.0187, OR=1.55,95%CI=1.07-2.26)。2. KCNMB4基因多态性与TLE的相关性在358例TLE患者和496例非癫痫对照受试者中,对KCNMB4基因上的4个标签SNPs (rs710665, rs11178214, rs9634299, rs7301967)进行分型。单位点分析未发现与TLE关联的SNP。这四个位点组成的单倍型C-C-G-T在TLE组的频率低于对照组频率(28.5%vs.33.6%, P=0.0258, OR=0.79,95%CI=0.64-0.98), P值经Bonferroni多重比较校正后统计学差异消失。TLE按是否合并海马硬化进行分组,rs7301967-C等位基因在TLE伴有海马硬化亚组的频率高于非癫痫正常受试者(53.6%vs.45.2%, P=0.041, OR=1.41,95%CI=1.01-1.95)=3. SLC6A12基因多态性与TLE的相关性在358例TLE患者和496例非癫痫对照受试者中,对SLC6A12基因上的4个标签SNPs(rs542736, rs2284329, rs216243, rs9783494)和1个功能区SNP(rs557881)进行分型。单位点分析未发现与TLE关联的SNP。单倍型分析提示rs542736位点与rs557881位点之间的联合作用与TLE相关,即在rs557881的AA基因型携带者中,rs542736的G等位基因与TLE及热性惊厥相关(P=6.6×10-5,0.012),并可影响SLC6A12基因表达(P=1.08×10-8),而在rs557881的GG基因携带者中rs542736的G等位基因的作用消失。4. BDNF基因多态性与TLE的相关性在360例TLE患者和501例非癫痫对照受试者中,BDNF基因的功能位点rs6265-A等位基因在TLE组的频率显著低于对照组频率(42.8%vs.49.6%, P=0.005, OR=0.76,95%CI=0.63-0.92)。临床表型分析发现rs6265与热性惊厥及海马硬化的发生相关(P=0.003,0.029)。在17例TLE患者和101例对照中分析血浆BDNF分泌水平,结果显示TLE组血浆BDNF水平显著高于对照组(p=4.71×10-7),但未发现rs6265不同基因型间血浆BNDF分泌水平存在差异。在12例伴有海马硬化TLE患者、17例不伴有单侧海马硬化TLE患者和29例对照中进行海马体积的测定,比较海马非对称性指数,结果表明海马硬化患者存在明显的海马对称性降低(P=2.85-10-5),但未发现rs6265对海马对称性的影响。研究结论本研究提示5-HTT、SLC6A12、BDNF基因是中国汉族人群TLE的易感基因；而KCNMB4基因对TLE的易感性贡献较小。研究背景发作性运动源性手足舞蹈徐动症(paroxysmal kinesigenic choreoathetosis, PKC)是一种罕见的发作性神经系统疾病,具有突然动作诱发、发作期间意识清醒等特点,临床表现为反复发作的肌张力障碍、舞蹈手足徐动等不自主运动,多为常染色体显性遗传。本实验室前期收集了4个PKC家系,将致病基因定位在16号染色体着丝粒附近(16p11.2-q12.1)。此区域为PKC的热点区域,但致病基因仍未被发现。新一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)具有高通量快速准确测序的特点,已成为识别遗传性疾病致病突变的有效手段。本研究利用NGS技术筛查PKC的致病基因。研究方法从前期收集的4个家系中选择5例PKC患者和1例正常对照(未携带风险单倍型),应用NimbleGen目标区域捕获芯片富集定位区域30Mb序列,并通过Illumina HiSeq2000平台进行测序。随后,应用Sanger测序法验证NGS结果,并对29例PKC散发患者进行突变筛查。研究结果利用NGS技术,每位家系患者中发现55个基因上的149～160种非同义变异、选择性剪接变异及编码区插入/缺失变异(NS/SS/I).通过与dbSNP129数据库、千人基因组计划数据库及1例正常对照的测序结果进行过滤后,在2个家系中鉴定出富含脯氨酸跨膜蛋白2基因(proline-rich transmembrane protein2, PRRT2)上2个杂合插入移码突变(c.369dupG and c.649dupC),引起氨基酸肽链截短(p.S124VfsX10and p.R217PfsX8)。Sanger法测序验证了以上结果并在1个家系中发现PRRT2基因的杂合错义突变(c.859G/A, p.A287T)。随后,在29例散发患者中,发现10例携带PRRT2基因突变,其中6例为c.649dupC突变。本研究共发现PRRT2基因的7种突变,建立了PKC的突变谱。研究结论PRRT2基因杂合突变可引起PKC的发生。除此以外,仍有部分患者未发现PRRT2基因突变,表明PKC具有遗传异质性。