【摘 要】
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目的:肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是一种极难治疗且死亡率高的肺部疾病。肺组织的损伤修复包含四个不同阶段,包括凝血期、炎症期、成纤维细胞增殖阶段,以及正常组织结构的最后愈合阶段。而PF发生与发展的关键是成纤维细胞的增殖和分化。肺部受损导致上皮/内皮细胞释放大量细胞因子,这些细胞因子会使炎症反应放大并进一步触发成纤维细胞增殖和分化,从而表达α-平滑肌肌动蛋白和细胞外基质成分。
【基金项目】
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国家自然科学基金（NO.8160010）； 辽宁省重点研发计划指导计划项目（NO.2018225077）；
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目的:肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是一种极难治疗且死亡率高的肺部疾病。肺组织的损伤修复包含四个不同阶段,包括凝血期、炎症期、成纤维细胞增殖阶段,以及正常组织结构的最后愈合阶段。而PF发生与发展的关键是成纤维细胞的增殖和分化。肺部受损导致上皮/内皮细胞释放大量细胞因子,这些细胞因子会使炎症反应放大并进一步触发成纤维细胞增殖和分化,从而表达α-平滑肌肌动蛋白和细胞外基质成分。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的组织修复/再生和免疫调节特性使其成为细胞治疗和组织再生的有希望的候选者,而作用的发生主要依靠具有旁分泌活性的分子分泌来激活。MSCs条件培养基（conditioned medium,CM）内含有其分泌的各种因子,如外泌体、微小RNAs（micro RNAs,miRNAs）等,后者已作为各种细胞过程（例如增殖、迁移、分化）的有效调节剂出现,并且人们正在探索其作为PF生物标志物的用途。我们推测骨髓来源MSCs（bone marrow-derived MSCs,BMSCs）及其CM可能通过miRNAs影响小鼠肺成纤维细胞（MLg）的增殖和分化,从而对PF发挥治疗作用。本实验旨在探讨miRNAs与PF的关系,明确其在MLg增殖和分化过程中的作用并探讨其可能的相关机制。研究方法:1、通过CCK-8细胞增殖实验检测BMSCs-CM和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）对MLg生存能力的影响。2、利用Western Blot实验检测BMSCs-CM以及BMSCs对MLg中纤维化标志物及TGF-β/Smad信号通路在蛋白水平上的表达,并利用q RT-PCR实验检测m RNA的表达。3、利用q RT-PCR检验BMSCs-CM、BMSCs以及MLg中miR-130a-3p的表达情况,以及分别观察BMSCs-CM及BMSCs与MLg共培养两种情况对MLg中miR-130a-3p表达的影响。4、通过CCK-8细胞增殖实验,免疫荧光实验、Western Blot以及q RT-PCR实验确定转染miR-130a-3p模拟物对MLg的增殖和分化的影响。5、应用小干扰RNA特异性敲减MLg中II型TGF-β受体（TGF-βRII）,通过CCK-8细胞增殖实验、免疫荧光实验、Western Blot以及q RT-PCR实验明确TGF-βRII对MLg增殖和分化的影响。6、用双荧光素酶报告基因检测miRNAs是否直接作用TGF-βRII。7、利用Western Blot以及q RT-PCR实验确定miR-130a-3p是否通过TGF-β/Smad信号通路参与BMSCs对PF的调节。结果:1、10 ng/mL TGF-β1处理MLg 24 h后细胞增殖能力达到最强。而BMSCs-CM能够抑制MLg的增殖能力。2、BMSCs-CM以及BMSCs能够在蛋白和转录水平上降低MLg中α-平滑肌肌动蛋白,纤粘蛋白以及TGF-β/Smad信号通路蛋白的表达水平。3、q RT-PCR结果显示BMSCs中含有较多的miR-130a-3p以及BMSCs与MLg共培养后,可以提高MLg中miR-130a-3p的表达。4、转染了miR-130a-3p模拟物的MLg,增殖和分化能力被抑制,并且α-平滑肌肌动蛋白、纤粘蛋白以及TGF-β/Smad信号通路的蛋白和m RNA水平降低。5、敲减TGF-βRII后,上述指标表达同样被抑制。6、miR-130a-3p可以直接作用于TGF-βRII,从而抑制其表达。7、miR-130a-3p通过TGF-β/Smad信号通路参与BMSCs对PF的调节。结论:BMSCs可能通过miR-130a-3p靶向TGF-βRII对肺成纤维细胞的增殖和分化产生影响,从而对PF有一定治疗作用。
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