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目的构建含有突变型APP的荧光真核表达系统以研究APP的酶解过程和Aβ产生的分子机制。方法以质粒pcDNA3.0-CFP-CaM-YFP的BglII酶切产物为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别得到编码蓝色荧光蛋白(cyan fluorescence protein, CFP)和黄色荧光蛋白碱基序列(yellow fluorescence protein, YFP);以pcDNA3.0-APP为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)得到含有APP717突变的最后300碱基片段(C99);生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54bp)。利用基因工程技术将CFP、54bp、YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP,酶切和测序鉴定。将构建的融合基因转染至SH-SY5Y细胞中,通过RT-PCR检测融合基因mRNA表达,利用多光子共聚焦显微镜观察不同时间点(12h、24h、48h、72h、96h)转染细胞内的荧光蛋白表达情况。细胞转染12h、18h、24h、36h、48h、72h后,检测FRET,予以波长为820nm的CFP激发光激发,采集发射波长为473nm的CFP图像,同时采集发射波长为525nm的YFP图像;计算CFP、YFP荧光强度(ICFP和IYFP)和两者的比率(Fret=IYFP/ICFP),绘制曲线。pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞48h后,利用多光子共聚焦显微镜观察细胞内黄色荧光蛋白的表达、分布以及YFP标记的Aβ去向。免疫细胞化学鉴定Aβ的生成。pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP转染细胞12h、24h、36h、48h、72h、96h后,MTT检测转染细胞活性,了解Aβ对细胞的影响。结果1、CFP、YFP、C99的PCR产物大小分别为818bp、738bp、325bp,经过不同的双酶切得到的酶切产物大小分别为702bp、723bp和310bp,电泳证实与预期一致;重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP分别经过不同的组合酶切,得到的目的片段长度正确;测序鉴定证明融合基因CFP-54bp-YFP-C99、CFP-54bp-YFP的序列与“gene bank”的碱基信息相符。2、将转染细胞进行RT-PCR显示有目的片段,分别对应于CFP-54bp-YFP-C99和YFP-C99,对照细胞内则无相应片段。3、转染细胞内有蓝色(和)黄色荧光表达,在转染12h后已经可以观察到细胞内有荧光分布,24h荧光逐渐增多,至48h荧光进一步增多增强,72h荧光有所减少,96h荧光明显减少减弱。4、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP细胞在转染后始终存在FRET,细胞轮廓光滑;pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99细胞在转染12h后有微弱FRET,以后无FRET,细胞内有颗粒广泛沉积。5、CFP-54bp-YFP转染细胞Fret不变; CFP-54bp-YFP-C99转染细胞Fret下降。6、CFP-54bp-YFP-C99在转染细胞48h后,能够被β、γ分泌酶裂解产生Aβ。7、Aβ产生于首先细胞内,聚集成颗粒,广泛分布于细胞内和细胞膜上,细胞外间隙也有少量分布,但没有形成明显沉积。8、Aβ形成后细胞形态异常。9、免疫细胞化学进一步证实Aβ的生成。10、MTT证实细胞内聚集的Aβ使得细胞活性下降,与对照组相比差异有统计学意义。结论1、荧光标记并含有Swedish (和APP717 )突变的重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP构建成功。2、融合基因在mRNA和蛋白水平均能够正确表达,为下一步研究APP裂解和Aβ产生提供了一种有力工具。3、FRET能够敏感准确的检测APP有无发生β裂解。4、CFP-54bp-YFP-C99能够被β分泌酶裂解而CFP-54bp-YFP不能被裂解,提示C99可能起到信号肽样的引导定位作用,对β分泌酶裂解APP具有重要意义;干扰C99可能会抑制Aβ的产生,本实验为探索AD的早期干预提供一种新思路。5、融合基因能够正确表达并被裂解,生成YFP标记的Aβ。6、Aβ产生于细胞内多个部位,并有少量被分泌至细胞外。7、Aβ在细胞外形成沉积之前,首先在细胞内聚集并产生继发性细胞毒作用,造成细胞活性下降,形态异常。