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红曲菌是一种丝状真菌,能够产生红曲色素、莫纳可林、麦角固醇等多种具有生物活性的代谢产物,具有很高的商业价值。但是由于红曲菌产桔霉素问题的存在,使红曲产品的安全性受到质疑。
本文采用基因敲除技术,构建了一株pksCT因缺失的基因工程红曲菌,为研究构建工业化菌株提供参考:利用蛋白质组学方法对一株红色红曲菌及其pksCT基因缺失株的蛋白质组进行了初步研究。主要内容如下:
1采用基因敲除了构建红曲菌M22的pksCT基因缺失株,利用潮霉素抗性筛选和基因组DNA的PCR验证,获得M22k红曲菌基因缺失株。通过HPLC检测原始菌株和缺失株液态培养物中的桔霉素含量,证实缺失株产桔霉素能力下降了73.6%~94.0%。
2利用TCA-丙酮法提取红色红曲菌总蛋白质,通过比较和分析培养基种类、蛋白质裂解液组成、水化上样条件等因素对双向电泳结果的影响,建立了红曲菌蛋白质组双向电泳体系。用YES培养基培养菌丝体6d,TCA-丙酮法提取粽蛋白质,蛋白质裂解液B(8M尿素,2M硫脲,4%CHAPS)溶解粗蛋白提取物,主动水化上样,双向电泳图谱中蛋白质样点数217,匹配率75%。
3采用双向电泳技术分析一株红曲菌及其pksCT基因缺失株的蛋白质表达差异,对pksCT基因缺失影响红曲菌蛋白质表达进行了初步研究。