斑马鱼(zebra fish),又名蓝条鱼、条鱼、斑马担尼鱼,原产于印度、孟加拉国。斑马鱼个体小,养殖花费少,能大规模繁育等诸多优点,因此已广泛成为脊椎动物中重要的发育生物学模式动物之一。然而,由于斑马鱼的胚胎干细胞技术不够成熟,因此无法像小鼠那样通过ES途径进行基因打靶。最近十几年来人们始终在不遗余力地尝试通过各种途径在斑马鱼中制备/筛选突变体,并已陆续建立多种方法,包括ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)化学诱变、反转录病毒插入诱变、基因诱捕和ZFN (Zinc finger nuclease)介导的定点突变等。但这些方法都有各自局限性,没有实现对斑马鱼的任意基因进行靶向修饰。近三四年兴起的TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)是基于植物病原体黄单胞菌分泌的一种转录激活子样效应因子而设计和构建。将TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合,在特定位点产生双链断裂,利用细胞自身的DNA修复机制(非同源末端连接NHEJ或同源重组修复HR)引入基因突变,基因修饰或基因敲入,从而实现基因组的定向编辑。此外,TALEN靶向基因敲除技术,能够根据需要选择任意的目标序列进行模块构建,从而具有更大的灵活性。本实验室通过前期工作发现了两个与心脏发育相关的基因,即CFL基因和CXXC5基因。它们共同含有一个CXXC结构域,在斑马鱼中属于同源度很高的两个基因,而在高等的脊椎动物中仅存在CXXC5基因。前期的初步结果证实了CFL和CXXC5基因在早期心脏发育中具有重要的作用。为了使结果更具说服力,本论文拟利用TALEN打靶技术敲除斑马鱼CFL和CXXC5基因,并欲构建出CFL和CXXC5基因的TALEN打靶敲除品系进而研究其相关作用。具体工作如下：首先利用靶位点设计软件选择CFL和CXXC5基因适合的靶位点,然后进行TAL靶点识别域的克隆构建,接下来将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体pCS2-PEAS和pCS2-PERR中,得到CFL和CXXC5基因的左右半位点重组核酸酶质粒。最后将重组真核表达质粒转录成mRNA通过显微注射到斑马鱼单细胞胚胎中,胚胎孵育24hpf～48hpf后提取基因组进行PCR,进一步酶切检测鉴定,目前已经完成了对CFL和CXXC5基因的初步筛选,其进一步的筛选工作正在进行中。