论文部分内容阅读
目的:利用网络药理学筛选失荅剌知丸治疗缺血性脑卒中（Ischemic stroke,IS）的先导化合物;通过细胞实验验证失荅剌知丸先导化合物对缺血/再灌注模型的药效,探讨其作用机制,为治疗IS的药物研发提供实验依据。方法:1.运用网络药理学技术筛选失荅剌知丸治疗IS的先导化合物。（1）失荅剌知丸活性成分及其作用靶点的筛选:检索中药系统药理学数据库与分析平台获得失荅剌知丸活性成分和对应作用靶点。（2）IS靶点收集:以“ischemic stroke”、“ischaemic stroke”和“cerebral infarct”为关键词检索疾病数据库OMIM、Gene Cards和Dis Ge NET获取IS靶点。（3）失荅剌知丸治疗IS的潜在效应成分及靶点筛选:药物作用靶点和疾病靶点绘制维恩图,筛选潜在先导化合物和作用靶点。（4）靶点间相互作用构建及关键靶点筛选:将靶点导入String数据库获得靶点间相互作用关系,根据靶点在网络中作用大小筛选出关键靶点。（5）靶点参与治疗IS的潜在机制探索:利用R软件进行基因本体论分析,获取靶点所参与调节的生物学过程,涉及的细胞组分和具有的分子功能;将靶点导入京都基因与基因组百科全书（KEGG）,获得靶点参与的信号通路。（6）化合物与靶点间相互作用评估:利用分子对接工具Autodock vina和Pymol将先导化合物与其对应靶点进行对接,评估二者间相互作用。2.通过体外实验研究失荅剌知丸先导化合物治疗IS的机制。（1）失荅剌知丸先导化合物药效的评估:将小鼠神经母细胞瘤细胞作为研究对象;将连二亚硫酸钠与无糖培养基联合使用模拟神经细胞缺血过程,用正常培养基替换缺血培养基模拟再灌注过程,来构建IS的细胞模型;采用CCK-8试剂盒和LDH释放实验评估先导化合物对N2a细胞活力和毒性的影响,评价失荅剌知丸先导化合物的药效。（2）失荅剌知丸先导化合物对OGD/R导致细胞凋亡的影响:利用Hoechst33342/碘化丙啶联合染色和JC-1染色,评估失荅剌知丸先导化合物对OGD/R诱导的N2a细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹检测先导化合物对OGD/R导致的N2a细胞内凋亡相关蛋白表达变化的影响。（3）失荅剌知丸先导化合物对OGD/R导致的细胞焦亡的影响:细胞免疫荧光检测焦亡相关蛋白NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1和GSDMD的表达及定位;蛋白免疫印记技术检测焦亡相关蛋白的表达情况。结果:1.失荅剌知丸中60种先导化合物可能通过参与调节116个靶点治疗IS。（1）将失荅剌知丸中所含中草药输入TCMSP数据库检索其活性成分,共获得82种符合要求的化合物成分,参与调节248个靶点。（2）通过检索疾病相关数据库,获得1197个IS相关靶点。（3）通过绘制药物作用靶点和IS疾病靶点的维恩图,获得失荅剌知丸中60种活性成分可能通过参与调节IS的116个靶点发挥治疗IS的作用。（4）靶点间相互作用网络共包含98个节点,289条边。节点的平均度值为5.898,平均聚类系数为0.454。其中,关键靶点为转录因子P65、转录因子激活蛋白AP-1和RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其可被槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇和鞣花酸等化合物调节。（5）GO分析结果显示:靶点涉及脂多糖、细菌源分子和营养调节等1755个生物学过程;且靶点存在于膜筏、膜微区和膜区等49种细胞组分;同时,靶点发挥结合类固醇、激活肾上腺素受体和结合血红素等136种分子功能。KEGG通路富集分析显示药物的活性成分参与调节脂质-动脉粥样硬化、血流剪切应力-动脉粥样硬化和糖尿病并发症相关AGE-RAGE等162条信号通路。（6）分子对接结果显示:“活性成分-靶点”结合良好。槲皮素和山柰酚参与调节的靶点最多,可能是治疗IS的关键先导化合物。2.槲皮素能减轻氧糖剥夺/再灌注（Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）对N2a细胞的损伤。（1）槲皮素减轻不同时间OGD/R对N2a细胞造成的损伤。分别对N2a细胞进行1 h、2 h、4 h和6 h氧糖剥夺处理,再灌注3 h、6 h、12 h和24 h后,检测不同组N2a细胞活力。结果显示,OGD/R导致细胞活力受下降,而给予槲皮素后能减轻细胞活力的降低。其中,缺血2 h后进行再灌注时槲皮素药效最为显著（P＜0.001）,而在缺血1 h、4 h和6 h后再灌注的槲皮素药效均不及缺血2 h组;山柰酚处理却未显示出类似结果。槲皮素减轻OGD/R导致的细胞毒性。LDH释放实验结果显示:OGD/R处理组LDH释放量为对照组的163.5%,显著高于对照组（P＜0.001）,而用槲皮素处理OGD/R组LDH释放量为对照组的117.4%,显著低于OGD/R组（P＜0.001）。（2）槲皮素减少OGD/R导致的N2a细胞凋亡。Hoechst 33342/碘化丙啶（PI）染色结果显示,OGD/R处理使得细胞核内染色质固缩、断裂且PI染色阳性的N2a细胞数多于对照组,而槲皮素处理后,染色质固缩、断裂及PI染色阳性的细胞数较OGD/R组减少。JC-1染色结果显示:N2a细胞经过OGD/R处理,线粒体膜电位下降,给予槲皮素后线粒体膜电位有所回升。蛋白免疫印迹检测结果显示:OGD/R组与对照组比较,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著下调（P＜0.01）,促凋亡蛋白Bad的表达水平则显著上升（P＜0.001）,cleaved Caspase-3水平显著上升（P＜0.001）;而槲皮素给药组与OGD/R模型组比较,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著上升（P＜0.05）,促凋亡蛋白Bad表达水平则显著下降（P＜0.001）,cleaved Caspase-3显著下降（P＜0.001）。（3）槲皮素抑制OGD/R所导致的N2a细胞焦亡。细胞免疫荧光检测结果显示OGD/R组焦亡相关蛋白NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1和GSDMD的表达有所增加,且GSDMD向边缘聚集,而给予槲皮素可以逆转这一现象。蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,OGD/R组NF-κB p65（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）、Caspase-1（P＜0.01）、cleaved GSDMD（P＜0.05）、IL-18（P＜0.01）、IL-1β（P＜0.001）水平显著升高,而pro-Caspase-1（P＜0.001）、GSDMD（P＜0.01）水平显著降低。给予槲皮素后,与OGD/R组相比,给药组NF-κB p65（P＜0.05）、NLRP3（P＜0.01）、Caspase-1（P＜0.01）、cleaved GSDMD（P＜0.05）、IL-18（P＜0.001）、IL-1β（P＜0.01）水平显著降低,而pro-Caspase-1（P＜0.001）、GSDMD（P＜0.01）水平显著升高。结论:失荅剌知丸先导化合物槲皮素可以减轻OGD/R导致的细胞活力下降及细胞毒性增加,减少神经细胞的凋亡和焦亡,保护神经,其机制可能与槲皮素抑制OGD/R诱导的Bad和NLRP3表达上调和调节Caspase-3、NF-κB p65和GSDMD的活化有关。