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丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一种公认的毒性物质,具有神经毒性、致癌性、基因毒性、生殖毒性和遗传毒性等。普通人群主要通过饮食摄入,职业人群可通过职业环境接触。ACR对人类和动物最主要的毒性作用是神经毒性作用,而对周围神经的毒性作用尤为明显。无论是实验动物还是在长期接触该物质的人群,都能导致其发生感觉和运动功能障碍,如骨骼肌无力、体重减轻、共济失调等症状。ACR主要作用于神经末梢,通过损害突触的传递而发挥神经毒性的作用。因此关注ACR对周围神经的损伤具有一定的现实意义。据研究显示,在ACR染毒后大鼠所出现的症状中,双后肢骨骼肌无力的表现尤为明显。坐骨神经作为下肢重要的的神经,对毒性作用最为敏感,同时腓肠肌受坐骨神经分支的支配,在后肢的运动中发挥着重要的作用,而腓肠肌运动终板(Motor endplate,MEP)是维持骨骼肌正常运动功能中至关重要的结构。坐骨神经又是由中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的脊髓前角运动神经元的轴突所组成,其功能状态必然与神经元的功能状态密切相关。因此,本课题选取腓肠肌MEP、坐骨神经及其对应节段的脊髓(腰骶膨大段)进行研究,分别检测其组织形态结构及相关蛋白表达的改变,探讨ACR染毒所致大鼠骨骼肌无力可能的原因,为临床上ACR中毒后的治疗提供实验依据。方法:1.建立动物模型:SPF级成年雄性SD大鼠32只,随机分为对照组(0mg/kg)、低(9mg/kg)、中(18mg/kg)和高(36mg/kg)剂量组,每组8只,分组灌胃染毒ACR,共21天。期间隔天称量体重,调整给药量,并每周进行一次行为学检测(步态评分和着陆足张开距离测量),第22天取材,并对腓肠肌进行湿重的称量。2.检测ACR对大鼠脊髓前角运动神经元的毒性影响:利用HE染色观察大鼠脊髓前角运动神经元形态的变化;Nissl染色检测大鼠脊髓前角运动神经元尼氏体含量的变化;透射电镜观察大鼠脊髓前角运动神经元突触的超微结构的改变;IHC和WB检测大鼠脊髓前角运动神经元AchE、CGRP和GAP43的表达情况。3.检测ACR对大鼠坐骨神经的毒性影响:利用HE染色观察大鼠坐骨神经结构的改变;透射电镜观察大鼠坐骨神经髓鞘板层超微结构的改变;LFB染色观察大鼠坐骨神经髓鞘脂类含量的表达情况;IHC和WB检测大鼠坐骨神经MBP和MAG的表达情况。4.检测ACR对大鼠腓肠肌运动终板的毒性影响:通过HE染色观察大鼠肌纤维结构的改变;氯化金染色观察大鼠神经末梢及MEP形态数目的改变;乙酰胆碱酯酶染色检测腓肠肌运动终板乙酰胆碱酯酶含量的改变;IHC和WB检测大鼠腓肠肌AchE和CGRP的表达情况。结果:1.大鼠行为学的改变:ACR染毒后大鼠体重从第三周开始,增长速率与染毒剂量呈负相关,高剂量组大鼠体重开始下降,组间比较差异显著;步态评分结果显示,对照组始终为1分,而低、中、高剂量组的得分均有所增加,且呈剂量依赖性,从第二周开始组间比较差异明显;着陆足张开距离结果显示,从第二周开始,高剂量组与其它组比较均显著增宽(P<0.01);从第三周开始,中剂量与对照组、低剂量组比较差异明显(P<0.01),低剂量组与对照组比较也有所增宽(P<0.01)。2.脊髓前角运动神经元的毒性改变:HE结果显示,ACR染毒后,运动神经元胞体分布稀疏,并出现萎缩、染色加深;染毒后中高剂量组尼氏染色范围变小(P<0.01),染色变浅,细胞内尼氏小体零星分布,细胞体积变小;透射电镜结果显示,高剂量组脊髓前角的突触数目较少,结构不清晰,着色浅,突触小泡和突触间隙的递质均较少;IHC和WB检测发现,与对照组相比,低、中、高剂量组AchE、CGRP和GAP43的表达均有所减少,呈剂量依赖性,差异显著(P<0.01)。3.坐骨神经的毒性改变:HE结果显示,ACR染毒后,低、中剂量组髓鞘呈现不同程度的肿胀,轴突结构发生改变;高剂量组神经纤维排列紊乱,髓鞘结构不清晰,轴突消失;透射电镜显示染毒后髓鞘板层有空洞形成,轴索变性,施旺细胞的细胞器溶解,有髓神经纤维之间有胶原纤维增生等现象;LFB髓鞘染色(伊红法)发现,染毒后髓鞘结构变薄变细,染色变浅且着色不均;IHC和WB检测发现,与对照组相比,各组MBP和MAG的表达均随染毒剂量增大而减少(P<0.01)。4.腓肠肌运动终板的毒性改变:腓肠肌湿重结果显示,与对照组相比,中剂量组大鼠腓肠肌湿重明显降低(P<0.05),高剂量组降低更为显著(P<0.01);HE结果显示染毒后肌纤维结构变细,排列密集,且有细胞核聚集的现象,剂量越高越明显;氯化金染色显示染毒后末梢神经分支变少、变细,神经纤维结构变短、变稀疏,MEP结构较少,染色变浅,结构不清晰;乙酰胆碱酯酶染色(亚铁氰化铜法)显示染毒后大鼠MEP形态变小,分布稀疏,且呈剂量依赖性,相比对照组,低、中、高剂量组乙酰胆碱酯酶含量均显著降低(P<0.01);IHC和WB检测发现,与对照组相比,低、中、高剂量组随染毒剂量增大,AchE和CGRP的表达逐渐减少(P<0.01)。结论:1.ACR损伤了脊髓前角运动神经元的正常结构和功能,可能与ACR使AChE、CGRP和GAP43的含量下降,从而使脊髓前角运动神经元生长及再生的功能受损、轴突退变、突触结构受损致信号传递障碍有关。2.ACR染毒损伤了大鼠坐骨神经的正常结构和功能,这可能是与ACR染毒导致了轴索变性、MBP和MAG蛋白的表达量下降所致神经脱髓鞘相关。3.ACR染毒所致大鼠腓肠肌湿重下降、MEP结构改变,可能是ACR导致了轴索变性引起轴浆运输功能障碍,进而使神经肌肉接头处AChE和CGRP等功能蛋白的含量下降有关。4.ACR可能通过损伤脊髓前角运动神经元的胞体及轴突,使其合成、运输蛋白能力下降,同时使坐骨神经脱髓鞘,神经末梢信号传递减弱,最终导致MEP退变,肌肉萎缩致骨骼肌无力的发生。