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目的:甲状腺激素对中枢神经系统的发育和功能至关重要。发育期或/和成年期发生的甲状腺激素缺乏均能导致海马结构和相应学习记忆功能的损伤。甲状腺激素主要通过结合其核受体来调控靶基因的表达,进一步发挥相应的生物学效应。本研究课题组成功构建了甲状腺激素核受体亚型1(TRα1-E403X)基因突变的小鼠模型,先前的研究观察到该模型突变小鼠离体海马学习记忆功能受损。本研究将进一步探讨TRα1-E403X突变对小鼠海马形态发育和功能的影响,并其作用机制将进行初步探讨。本研究也将采用高敏感性和特异性的RNAscope?分析原位杂交(ISH)方法来检测甲状腺激素核受体亚型1(TRα1)在小鼠不同发育时期海马组织中的表达情况。方法:采用本课题组已经制备的TRα1-E403X突变模型小鼠,繁育实验用的各种基因型雄性小鼠。实验时点分为出生后0天、7天、3周龄、6周龄和16周龄。实验项目:1.应用RNAscope?原位杂交(ISH)技术来观察小鼠不同发育时期海马组织中TRα1的表达情况。2.对P0、P7、3、6和16周龄小鼠进行脑组织尼氏染色观察海马形态发育;3.对16周小鼠进行零迷宫、旷场、新异物体识别实验、悬尾实验评估小鼠相应的学习记忆功能和恐惧焦虑、抑郁水平;4.对3和16周小鼠进行海马组织表达谱测序,筛选与海马结构发育及功能相关的差异表达基因,并进一步在3和16周小鼠海马组织中应用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)对筛选出的差异表达基因进行验证。结果:1.RNAscope?分析原位杂交(ISH)结果:小鼠的不同发育时期,观察到从小鼠胚胎早期原始神经管发育到海马形态发育成熟的整个过程中,原始神经上皮细胞和海马各亚区均有TRα1表达,且在海马形态发育高峰时期,TRα1表达也处于高峰。2.形态学实验结果:P0时点:TRα1-E403X纯合突变小鼠与野生型小鼠海马组织尼氏染色相比,纯合突变小鼠海马体积较小,在海马槽区神经上皮层仍较厚;此时,向海马CA1区进行迁移的锥体细胞占据海马CA1区全层,海马CA1区始发层尚未出现,锥体细胞尚未迁移定居在锥体细胞层而在中间层逗留,分散于海马CA1区;杂合突变型小鼠与野生型小鼠海马形态类似,但其锥体细胞大多数仍旧逗留在中间层,只有小部分锥体细胞迁移至CA1区的锥体细胞层,而已完成迁移定居的锥体细胞数量少,细胞排列分散,不集中。P7时点:纯合突变小鼠海马组织尼氏染色,与野生型小鼠海马形态相比,海马槽区域仍旧有部分神经上皮细胞尚未完成向海马CA1区的迁移,海马CA1区锥体细胞部分完成了迁移定居,仍有许多细胞仍在迁移中,逗留在中间层,此时海马CA1区三层结构也逐渐清晰;已完成迁移定居的海马CA1区的锥体细胞体积小,数目少,不如野生型小鼠锥体细胞排列致密整齐。杂合突变小鼠海马组织尼氏染色结果介于野生型小鼠和纯合突变小鼠之间。3周龄时点:杂合突变型小鼠和纯合突变型小鼠与野生型小鼠海马形态相比,海马CA1区的锥体细胞完成了迁移定居,且海马CA1区三层结构清晰,但完成迁移定居的海马CA1区锥体细胞层的锥体细胞数量少,细胞排列分散,不集中,不如野生型小鼠锥体细胞排列整齐。6周龄时点:杂合突变小鼠与野生型小鼠海马形态相比,海马CA1区三层结构清晰,但海马CA1区锥体细胞层的锥体细胞排列分散,不集中,不如野生型小鼠锥体细胞排列整齐。16周龄时点:杂合突变型小鼠与野生型小鼠海马CA1区形态相比,海马CA1区三层结构清晰,海马CA1区锥体细胞层的锥体细胞形态及排列情况无明显差异。3.行为学实验结果:16周龄杂合突变小鼠在零迷宫实验中,小鼠总运动距离缩短,僵直不动时间比例增加,进入开臂次数及探头次数均减少,排出大便个数增加,且差异均有统计学意义。在悬尾实验中,16周龄杂合突变小鼠僵直不动时间延长,但差异无统计学意义。其它实验项目中未发现杂合突变小鼠有明显异常的表现。4.海马组织表达谱测序及验证结果:3周龄纯合突变小鼠海马组织中Calml4和RC3表达降低,NGF和c-Fos表达无差异。3周龄杂合突变小鼠海马组织中Calml4和c-Fos表达降低;16周龄杂合突变小鼠海马组织中c-Fos表达降低。结论:1.从小鼠胚胎早期神经管形成到海马发育成熟的各个时期,TRα1在神经管原始神经上皮细胞和海马组织各亚区均有表达,并且在海马CA1区发育高峰时期TRα1的表达量升高。2.TRα1-E403X基因突变引起突变小鼠海马CA1区神经细胞迁移延迟,细胞数目减少,排列分散,不规整。3.TRα1-E403X突变小鼠存在学习记忆能力的损害,且当外界存在应激环境时,更易于出现恐惧焦虑的情绪,也有一定程度的抑郁倾向;4.TRα1-E403X突变会下调突变小鼠海马组织中与突触可塑性相关的分子表达,提示该受体的突变可能参与对这些分子在海马组织中的表达调控,从而导致突变小鼠出现海马相关的功能损害。