海洋微生物Marinifilaceae bacterium木聚糖酶XynSPP2的异源表达及应用初探

来源 :武汉轻工大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zzbluebus
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在经济快速发展的时代背景下,资源短缺等问题日益突出,寻求经济有效的可再生资源成为一切得以持续发展的重中之重。木聚糖作为半纤维素的主要成分,是自然界第二大可利用的自然资源,但是由于其难以被分解利用,导致很多自然资源的浪费。木聚糖酶在木聚糖水解过程中起着十分重要的作用,是将木聚糖水解成为低聚木糖的关键酶,在工业应用以及减少资源浪费等方面都有着重要的价值。不同环境和来源的木聚糖酶在结构和功能上不尽相同,为寻找更具有特异性的酶来满足工业生产的需要,研究者往往会从一些极端环境之中寻找功能特异的酶,比如冰川、海洋、极地。本研究以海洋微生物Marinifilaceae bacterium SPP2来源的新型双结构域木聚糖酶XynSPP2作为研究对象,对其序列进行分析,发现它包含两个结构域,分别是GH10催化结构域和纤连蛋白III型结构域(Fn3)。本文分别实现了其在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源表达,并且初步分析Fn3结构域对于酶特性的影响。本研究还对其酶解产物的成分进行了分析,证实它可用于低聚木糖的生产。本研究的主要结果为:(1)分别克隆得到M.bacterium SPP2全长木聚糖酶XynSPP2-FL和Fn3缺失型XynSPP2-△Fn3,在E.coli BL21中实现异源表达。该表达产物的反应最适温度为50℃,最适p H为6.0,p H耐受范围较广。对两者的酶促反应动力学数据进行分析,可知XynSPP2-FL和XynSPP2-△Fn3的kcat值分别为178.19和117.27 s-1。XynSPP2-FL的催化效率约为XynSPP2-△Fn3的三倍,XynSPP2-FL在大肠杆菌中分泌蛋白的比酶活为226.56 U/mg。结果表明Fn3结构域的加入能够有效提高酶活性及催化效率。(2)为适应工业应用,将XynSPP2转入到毕赤酵母中,成功实现了胞外分泌表达。XynSPP2在酵母表达系统中最适反应温度为40℃,金属离子对它的影响不明显,正丁醇会完全抑制其活性,在5%的甲醇、乙醇等有机溶剂中其活性减少一半左右。XynSPP2具有明显的底物特异性,在测试的底物中只对山毛榉木木聚糖表现出活性,在0.5 M的Na Cl环境中其活性可提高10%左右,具有很强的耐盐性。以山毛榉木木聚糖为底物进行水解反应,水解产物中的主要成分包括木二糖、木三糖和木四糖,表明其可用于制备低聚木糖。(3)通过单因素条件优化,得到碱法自制玉米芯木聚糖的最适条件,固液比为1:10,Na OH浓度为10%,煮沸时间为100 min,以此方法得到木聚糖3.20g,得率为6.2%。水解玉米芯木聚糖的最适条件为40℃,加酶量35 U/mg,底物浓度10%,水解产物成分为木二糖~木四糖。
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