论文部分内容阅读
根瘤菌与豆科植物建立共生固氮体系是一个复杂的信号交流过程,涉及豆科植物和根瘤菌双方多类基因的参与,根瘤菌三型分泌系统就是其中之一。全基因组测序结果显示,实验菌株Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123基因组上有两套三型分泌系统T3SS-1、T3SS-2。前期的研究结果表明其T3SS-1在与刺槐的共生中发挥重要作用,那么T3SS-2是否参与共生,若参与,它在共生中发挥怎样的作用,若不参与,T3SS-2又有哪些其他方面的功能。首先,我们对T3SS-1与T3SS-2基因簇中结构基因的组成和排列、系统发育关系、共生中涉及的经典调控序列以及共有结构基因的诱导表达等方面进行了分析。其次,利用同源重组原理构建了RhcN2基因敲除突变菌株Δ2076,使T3SS-2失去原有的生物活性。最后,将野生型菌株与Δ2076菌株分别回接宿主刺槐,观察突变菌株对刺槐表型及根瘤内部结构的影响,推断其是否在这一共生固氮体系中发挥作用。另外,初步探索了T3SS-2在细菌游动性以及重金属抗性中的作用。实验主要得到以下结论:(1)T3SS-2并非是T3SS-1简单的拷贝,其结构基因组成与排列、系统发育关系以及调控序列等均不相同;(2)共生信号分子类黄酮诱导12 h、24 h时,部分T3SS-1结构基因表达显著上调,而T3SS-2结构基因未响应类黄酮诱导。诱导48 h后,T3SS-2的结构基因表达上调;(3)Δ2076回接刺槐实验发现,接菌30 d时刺槐叶片颜色、所结根瘤数目、根瘤干重等与接野生型菌株的刺槐相比并无明显差别,但45 d后接种Δ2076菌株的刺槐叶片出现发黄现象,刺槐根长、株高虽无明显差别,但根瘤数目以及固氮酶活出现显著下降,根瘤石蜡切片和透射电镜切片与野生型根瘤相比也有明显区别;(4)Δ2076游动性与野生型相当,对二价铜的抗性有轻微的下降。实验结论表明Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123 T3SS-2以一种目前尚未知的方式影响着与刺槐的共生固氮过程,推测在共生后期发挥作用,可能与根瘤的提前衰老有关。