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研究背景和目的细胞质多聚腺苷酸结合蛋白3(CPEB3)靶向连接mRNAs。我们的既往研究表明CPEB3与结直肠癌(CRC)患者的预后相关,但其在结直肠癌中的分子机制和调控网络仍不清楚。本课题拟通过检测CPEB3、CD86和CD163在结直肠癌组织和细胞中的表达,初步分析CPEB3与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)标志分子的相关性,并通过一系列分子生物学实验,探究CPEB3在结直肠癌免疫微环境中的调控机制,寻找结直肠癌治疗的新靶点。研究方法1.CPEB3,CD86和CD163在结直肠癌组织和细胞中的表达和相互关系(1)在结直肠癌组织中,分别通过qRT-PCR和IHC检测CPEB3,CD86和CD163在其中的表达;(2)构建巨噬细胞和结直肠癌细胞体外共培养模型,qRT-PCR和flow cytometry检测CD86和CD163表达;Luminex assays检测TAM上清中细胞因子的表达。2.CPEB3抑制TAM分泌IL-6促进结直肠癌细胞上皮间质转化(EMT)的作用(1)通过Luminex assays和ELISA实验检测TAM上清中IL-6的分泌;通过CCK8和Transwell实验检测TAM上清刺激的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力;(2)IL-6刺激稳转CPEB3的结直肠癌细胞,通过CCK8和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭的能力。3.CPEB3抑制TAM上清促进结直肠癌细胞EMT作用的分子机制(1)通过RIP-seq和通路富集,发现结直肠癌细胞中CPEB3调控IL-6R/STAT3信号通路;(2)通过双荧光素酶报告基因实验证实CPEB3对IL-6R基因的转录后调控作用。4.CPEB3通过调控结直肠癌细胞CCL2的分泌来改变TAM极化(1)通过Luminex assays检测稳转CPEB3的结直肠癌细胞上清中细胞因子的分泌;在共培养体系中加入CCL2中和抗体,通过flow cytometry检测CD86和CD 163的表达。5.体内实验验证CPEB3抑制肿瘤发生和改变TAM的极化(1)通过稳转CPEB3的结直肠癌细胞裸鼠皮下瘤形成实验记录肿瘤大小和生长速度;通过IHC实验检测皮下瘤组织中Ki67、E-cadherin和Vimentin的表达;(2)经flow cytometry实验检测皮下瘤组织中CD86和CD206的表达;Western Blot检测皮下瘤组织中IL-6R/STAT3信号通路的关键信号分子。结果1.IHC分析结果显示,与低表达CPEB3癌组织相比,高表达CPEB3癌组织中CD86阳性细胞数增多而CD 163阳性细胞数降低;2.Luminex assays和ELISA实验表明IL-6为TAM上清中重要因子;3.CPEB3直接结合IL-6R mRNA调控IL-6/STAT3信号通路而抑制TAM促进结直肠癌细胞EMT的作用;同时抑制结直癌细胞CCL2分泌而减少M2样TAM的极化;4.体内实验证实CPEB3抑制肿瘤发生和改变TAM的极化方向。结论CPEB3在结直肠癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞相互作用网络中可能具有一定的调控作用,而这一发现可能成为结直肠癌治疗的新颖且有希望的治疗靶点。