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第一部分TRPM2在脓毒症巨噬细胞清除细菌中的作用研究目的:TRPM2（Transient Receptor Potential Melastatin 2,TRPM2）是一种非选择性Ca2+通透性阳离子通道。近年来研究发现TRPM2通道激活后在溃疡性结肠炎、心肌缺血再灌注损伤、神经病理性疼痛、自发性脑脊髓炎等疾病中发挥重要作用,因此TRPM2具有调控细胞因子产生、胰岛素释放、细胞活力、凋亡等多样的功能。而TRPM2调控巨噬细胞防御病原体入侵的先天免疫防御机制尚不十分清楚,因此本部分研究首先探讨了TRPM2对腹腔感染大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）脓毒症模型预后的影响以及巨噬细胞TRPM2对细菌清除的作用。研究方法:采用腹腔感染E.coli脓毒症模型,观察野生型小鼠（WT）和TRPM2基因敲除小鼠(Trpm2-/-)脓毒症的72h生存率。模型后的2h、6h、12h取腹腔灌洗液,用琼脂平板法检测腹腔细菌负荷。离体培养野生型和TRPM2基因缺陷型腹腔巨噬细胞,观察巨噬细胞的细菌吞噬能力及细菌清除能力。分离培养1个对照和3个脓毒症患者外周血单核巨噬细胞,检测TRPM2mRNA的表达,同时,观察单核巨噬细胞对细菌的清除能力。研究结果:腹腔感染E.coli模型后,Trpm2-/-小鼠72h生存率较WT小鼠明显降低（15.0%vs.45.5%,**P<0.01）。Trpm2-/-小鼠2h、6h、12h腹腔灌洗液细菌负荷较WT小鼠明显增高（*P<0.05、**P<0.01、**P<0.01）。离体培养野生型和TRPM2基因缺陷型腹腔巨噬细胞,两组细胞对E.coli的吞噬能力并没有明显改变,而2h和6h后TRPM2基因缺陷型腹腔巨噬细胞对E.coli的清除能力明显低于WT型细胞。分离培养1个对照和3个脓毒症患者外周血单核巨噬细胞,检测TRPM2mRNA的表达,发现脓毒症患者外周血单核巨噬细胞中TRPM2表达越高,细胞对细菌的清除能力越强,反之,TRPM2表达最低的细胞,对细菌的清除能力最弱。研究结论:TRPM2缺陷不利于巨噬细胞对E.coli的清除,增加脓毒症的死亡率。第二部分TRPM2影响巨噬细胞杀菌活性的机制研究研究目的:第一部分研究发现TRPM2通过调控巨噬细胞细菌清除能力,从而在脓毒症发生发展中起到保护作用。因此,本部分研究通过观察巨噬细胞吞噬细菌后细胞内吞噬体的动态变化特征,探讨TRPM2参与巨噬细胞杀菌过程的分子机制。研究方法:pHrodo偶联的E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞并于刺激后20min、40min、60min、80min 及 1OOmin 后检测吞噬体内的 pH 值。对 WT 及 TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞进行吖啶橙染色,观察两组巨噬细胞内溶酶体的酸性。E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞后,观察刺激前后两组巨噬细胞内溶酶体内的水解酶cathepsin D（CTSD）的成熟情况。荧光E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞后进行LysoTracker Red DND-99染色,观察刺激后两组巨噬细胞内含E.coli吞噬体的酸化及融合情况。荧光E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞后,观察E.coli与溶酶体膜标记物LAMP-1的共定位情况。采用超速离心技术分离到WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞吞噬体,通过免疫荧光和western blot两种方法观察吞噬体上LAMP-1、CTSD、Rab7的表达情况。通过免疫荧光动态观察WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞吞噬体上Rab5和EEA-1的变化特点。E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞后,免疫共沉淀方法观察Rab5和EEA-1的相互作用。研究结果:pHrodo偶联的E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞,刺激后20min和40min,两组细胞吞噬体内的pH值变化不大;60min时,尽管两组细胞吞噬体pH值变化无统计学意义,但是WT型细胞吞噬体内酸化程度高于TRPM2缺陷巨噬细胞;80min和1OOmin时,WT型细胞吞噬体明显酸化,而TRPM2缺陷细胞吞噬体酸化程度明显缓慢（*P<0.05,**P<0.01）。吖啶橙染色显示,两组巨噬细胞溶酶体的酸性并没有明显变化。E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞后（Omin、30min、60min、120min）,两组细胞溶酶体内的成熟CTSD无明显变化。LysoTrackerRed DND-99染色显示,两组巨噬细胞溶酶体的酸性并没有明显变化,而E.coli·刺激120min后,TRPM2缺陷细胞内包绕在E.coli吞噬体周围的酸性溶酶体较WT型细胞明显减少。荧光E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞120min后,TRPM2缺陷细胞LAMP-1阳性吞噬体数量明显低于WT型细胞。采用超速离心技术分离到WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞吞噬体,结果发现:微球刺激120min后,TRPM2缺陷细胞吞噬体上LAMP-1的荧光强度明显低于WT型吞噬体,TRPM2缺陷细胞吞噬体上Rab7的荧光强度也明显低于WT型吞噬体;微球刺激60和120min后,TRPM2缺陷细胞吞噬体上LAMP-1的蛋白表达明显低于WT型吞噬体,TRPM2缺陷细胞吞噬体上CTSD的蛋白表达明显低于WT型吞噬体,TRPM2缺陷细胞吞噬体上Rab7的蛋白表达也明显低于WT型吞噬体。通过免疫荧光动态观察WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞吞噬体上Rab5和EEA-1的变化,结果发现:在吞噬体成熟的过程中,野生型巨噬细胞吞噬体上Rab5的表达逐渐减少,同时Rab5的栓系分子EEA-1的表达也逐渐减少;相反地,TRPM2缺陷型巨噬细胞吞噬体上Rab5的表达并没有随着吞噬体的成熟过程而表达减少,同时EEA-1始终低表达。E.cli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞30min后,TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞内Rab5与EEA-1的相互作用较WT型细胞明显降低。研究结论:TRPM2缺陷并不直接影响巨噬细胞溶酶体的酸化和成熟,而是阻碍吞噬体与溶酶体的融合;TRPM2缺陷通过降低Rab5与EEA-1的相互作用减少吞噬体的成熟。以上结论反映了 TRPM2缺陷可能通过阻碍巨噬细胞吞噬体成熟影响吞噬体与溶酶体的融合。第三部分TRPM2调控巨噬细胞胞内钙离子浓度在吞噬体-溶酶体融合中的作用研究目的:综合前两部份的研究结果,TRPM2缺陷降低吞噬体成熟、阻碍腹腔巨噬细胞对细菌的清除、增加腹腔细菌负荷,从而加重脓毒症的预后。为了深入探讨TRPM2做为靶标进行干预的效果,我们采用离子霉素来调节TRPM2缺陷引起的巨噬细胞内[Ca2+]i减少,观察TRPM2调控的[Ca2+]i的改变对巨噬细胞吞噬体-溶酶体融合以及脓毒症预后的影响。研究方法:对照溶剂或者2μM离子霉素处理TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞5min,观察细胞内Ca2+信号。包被有细菌外膜粗提物的微球刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞60min后,对照溶剂或者离子霉素处理5min,再放置55min,然后采用超速离心技术分离得到巨噬细胞吞噬体,通过免疫荧光法和免疫印迹观察吞噬体上LAMP-1的表达情况。对照溶剂或者离子霉素处理WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞5min后,E.coli刺激细胞30min,免疫共沉淀方法观察Rab5和EEA-1的相互作用。WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞吞噬E.coli 1h,对照溶剂或者离子霉素处理5min后,庆大霉素实验观察巨噬细胞的细菌清除能力。对照溶剂或者离子霉素处理巨噬细胞5min后,分别回输到Trpm2-/-小鼠体内（5×105/只）,观察E.coli腹腔感染模型的生存率和细菌负荷。研究结果:对照溶剂或者2μM离子霉素处理TRPM2缺陷腹腔巨噬细胞后,离子霉素处理组细胞内的Ca2+信号强度明显增高。离子霉素处理的TRPM2缺陷巨噬细胞组吞噬体上LAMP-1的荧光表达强度及蛋白表达较对照溶剂处理的TRPM2缺陷巨噬细胞组明显增强,离子霉素处理组的LAMP-1的荧光表达强度和WT型巨噬细胞组无明显差异。E.coli刺激后,和对照溶剂处理的TRPM2缺陷巨噬细胞组相比,离子霉素处理的TRPM2缺陷巨噬细胞组的Rab5和EEA-1的相互作用明显增强。和对照溶剂处理的TRPM2缺陷巨噬细胞组相比,离子霉素处理的TRPM2缺陷巨噬细胞组2h和6h的细菌负荷明显降低。和对照溶剂处理的TRPM2缺陷巨噬细胞回输Trpm2-/-小鼠体内相比,离子霉素处理的TRPM2缺陷巨噬细胞回输明显增加E.coli腹腔感染模型的生存率,降低腹腔细菌负荷。研究结论:离子霉素处理提高TRPM2缺陷巨噬细胞内的[Ca2+]i能够促进吞噬体和溶酶体融合;提高细胞内的Ca2+浓度能够提高巨噬细胞内Rab5和EEA-1的相互作用;提高细胞内的Ca2+浓度能够增加巨噬细胞的细菌清除能力;离子霉素处理的TRPM2缺陷巨噬细胞回输能够提高E.coli腹腔感染模型的生存率,降低腹腔细菌负荷。以上结论反映了 TRPM2通过调控细胞内的Ca2+浓度影响Rab5和EEA1的相互作用,促进吞噬体和溶酶体融合及细菌降解。