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研究背景类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以滑膜炎为中心病理的自身免疫性疾病,属于中医痹证的范畴,也是痹证的代表性病种。RA活动期有两种类型,一种是关节红肿热痛均显著,此类当属中医“热痹”;另一种是关节肿胀疼痛明显,但皮色不红,触之不热,肿胀程度可轻可重,能触及增厚的滑膜,此属中医的“寒痹”。痹证动物模型是探讨中医痹病的病因病机理论的重要实验载体,既往研究表明,胶原诱导性关节炎模型（Collagen-induced arthritis,CIA）模型属于热痹;人肿瘤坏死因子 α（Human Tumor Necrosis Factor-α,hTNF-α）转基因小鼠（Tgtc）是在FVB背景鼠内过表达hTNFα基因,可以自发出现持续性、进展性的关节肿胀、畸形,其病理提示关节内以大量的滑膜增生、进展性的软骨侵蚀、骨质破坏为特征,这些表现与人寒痹类似,且本课题组前期研究发现风湿热环境以及乌头汤治疗均可以缓解Tgtc小鼠关节炎症状,进一步证实了 Tgtc关节炎的寒痹属性。临床上RA患者关节炎往往不能由单一证型所代表,往往存在寒热错杂、寒热转化等错综复杂的证候特点。但目前RA动物模型仅能模拟出单一证型表现,我们希望在hTNFα转基因鼠寒痹基础上通过CIA造模或其他造模方法诱导其产生急性关节炎表现,从而实现寒热痹之间的转换,更好的模拟人RA复杂的证型变化。研究内容第一章 在hTNFα转基因小鼠关节炎基础上进行Ⅱ型胶原诱导的研究目的:观察Ⅱ型胶原（CⅡ）诱导是否能在hTNFα转基因小鼠关节炎基础上诱发急性关节炎表现,从而建立寒痹向热痹转化的动物模型,并探究其发病机制。方法:将Tgtc小鼠与DBA/1小鼠杂交产生F1代小鼠经基因鉴定后按随机数字表法分为阴性对照组（WT-NC组）、空白对照组（hTNFα-NC组）、实验组（hTNFα-CIA组）、条件对照组（WT-CIA组）,每组8只,对hTNFα-CIA组、WT-CIA组进行CIA造模,其余两组用生理盐水造模作为对照。造模后观察记录各组小鼠关节直径、关节炎指数。10周后进行血清CII特异性IgG和IgG2a ELISA法检测、脾脏淋巴细胞增殖试验、关节组织病理、TRAP染色、微血管密度计数及免疫组化等检测。结果:CIA造模后,WTCIA组表现为关节弥漫性红肿,hTNFα-CIA组小鼠未出现类似急性关节炎表现,主要表现为进展性关节畸形,伴轻中度肿胀,无明显发红;病理提示广泛性滑膜细胞增生和骨侵蚀,大量血管新生,中度炎症浸润,较hTNFα NC组小鼠相比,其关节炎表现及炎性浸润情况均无明显变化（P>0.05）,但骨侵蚀加重（P<0.05）;与WT-CIA组比较,hTNFα-CIA组血清中特异性IgG水平相当（P>0.05）,IgG2a抗体含量减少（P<0.05）,脾脏淋巴细胞特异性、非特异性增殖能力均降低（P<0.05）,hTNFα-CIA组滑膜组织存在少量CD20+细胞,但无CD3+细胞分布;hTNFα-NC组比较,hTNFα-CIA组关节软骨下骨及骨-滑膜中巨噬细胞及破骨细胞数量略有增加（P<0.05）。结论:hTNFα小鼠存在T细胞耐受,导致Ⅱ型胶原诱导不能使寒痹基础模型向热痹转化,但其可通过增加滑膜组织中特异性CⅡ抗体、巨噬细胞和破骨细胞数量以加重骨破坏。hTNFα转基因小鼠关节炎更符合中医（?）痹范畴。第二章蛋白聚糖、胶原抗体诱导寒痹模型向热痹转化的实验研究目的:探究CAIA、PGIA、CIA足背造模方法是否能在Tgtc小鼠关节炎基础上诱发急性关节炎表现,建立寒痹向热痹转化的动物模型。方法:在Tgtc小鼠基础上建立①CAIA模型:DBA小鼠CIA造模后分离血清,Tgtc、FVB小鼠腹腔注射含CⅡ抗体的血清,并使用脂多糖（LPS）加强,进行CAIA造模;②PGIA模型:Tgtc小鼠、FVB小鼠和BALB/c小鼠分别予PGIA造模,PG与DDA佐剂充分混合后于第0、3、6周腹腔注射免疫;③CIA足背造模:FVB、Tgtc小鼠,将CⅡ乳化剂于第0天、第14天于足背部进行皮内注射。均设置相应对照组,观察记录各组小鼠关节直径、关节炎指数变化等大体表现,观察是否能够诱导产生急性关节炎症状。对PGIA各组小鼠进行关节病理检测,结果:CAIA、PGIA及CIA足背造模后,Tgtc小鼠均为出现急性关节炎表现,与未造模Tgtc小鼠比较,Tgtc小鼠踝关节直径、炎症指数评分、色差值及关节病理表现均无明显变化（P>0.05）。结论:CAIA、PGIA、CIA足背造模方法均无法诱导Tgtc小鼠发生急性关节炎,无法加重其关节炎症,诱导寒痹向热痹转换模型失败。全文小结1.诱导性关节炎造模方法均不能加重hTNFα转基因小鼠关节炎临床表现和关节内炎症浸润。可能是由于其长期处于TNFα刺激中,导致体内T淋巴细胞处于免疫耐受状态,不足以对诱导剂产生强烈的炎症反应。2.hTNFα转基因小鼠长时间暴露于TNFα刺激下体内T淋巴细胞Th1/Th2亚群平衡可能受损。3.hTNFα转基因小鼠通过TNF激活破骨细胞相关通路,促进破骨细胞分化成熟及活化从而引起广泛骨质破坏。4.hTNFα转基因小鼠关节病理表现为大量滑膜成纤维细胞增生及严重骨质破坏,同样存在炎性细胞浸润,属于RA晚期关节炎症表现,可能与中医（?）痹-痰瘀痹阻证更类似。5.CAIA、PGIA造模不能诱导Tgtc小鼠寒痹向热痹转化。