【摘 要】
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研究背景嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T）免疫疗法在治疗血液系统肿瘤中取得了令人兴奋的成果。然而,CAR-T免疫治疗所导致的肿瘤溶解综合征、致命性细胞因子释放综合征、CAR-T相关脑病综合征和脱靶效应等副作用不容忽视。如何进一步提高CAR-T临床应用的可控性和安全性成为目前研究的重中之重。分子开关的设计可能是改善给药后不良反应、抗原
【基金项目】
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湖北省卫生计生委重点支撑项目（WJ2019H093）；
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研究背景嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T）免疫疗法在治疗血液系统肿瘤中取得了令人兴奋的成果。然而,CAR-T免疫治疗所导致的肿瘤溶解综合征、致命性细胞因子释放综合征、CAR-T相关脑病综合征和脱靶效应等副作用不容忽视。如何进一步提高CAR-T临床应用的可控性和安全性成为目前研究的重中之重。分子开关的设计可能是改善给药后不良反应、抗原丢失、复发突变和异质肿瘤的有效策略。PNE多肽（Peptide neo-epitope,PNE）来源于酵母转录因子GCN4的14个氨基酸肽段（NYHLENEVARLKKL）,PNE虽为外源肽,但已证实其在体内具有低免疫原性、给药后诱导机体产生中和性抗体能力弱的特征。PNE能与CAR前端由抗PNE单抗（52SR4）构成的单链可变片段高亲和力结合,可通过将PNE与识别肿瘤相关抗原的抗体或亲和肽连接,引导及桥接CAR-T细胞与靶细胞结合,可调控式杀伤肿瘤细胞。目的本实验旨在通过构建过表达Anti-PNE CAR的慢病毒载体,感染人活化T细胞,从而构建PNE多肽调控通用型CAR-T细胞,实现CAR-T细胞通用化、模块化,为通用型CAR-T细胞临床应用个性化、效应精准化打下基础。方法PCR 扩增人源化的 Anti-PNE CAR 序列（Anti-PNE scFv-IgG4m-CD8-CD137-CD3ζ）,克隆到质粒GV401中,经阳性克隆筛选和测序验证后进行质粒抽提,获得重组质粒Anti-PNE GV401;三质粒系统（Anti-PNECAR GV401、pHelper 1.0和pHelper 2.0）共转染HEK 293T细胞包装慢病毒;梯度稀释法测定慢病毒载体滴度;实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）验证质粒目的基因表达;Ficoll-Paque密度离心法分离外周血单个核细胞;CCK-8试剂检测T细胞增殖能力及活性;流式细胞术检测激活后T细胞比例动态变化及活化表型CD25、CD69的表达情况;用构建的慢病毒载体感染活化T细胞,荧光显微技术观察转染效率;RT-qPCR检测Anti-PNE CAR-T细胞CAR mRNA的相对表达。结果重组质粒测序结果与目的序列一致,表明成功构建重组质粒载体Anti-PNE CAR GV401;显微镜下质粒转染后的HEK 293T细胞内有高强度的绿色荧光,RT-qPCR检测显示CAR mRNA的相对表达明显高于对照组,表明质粒目的基因表达正常,成功包装得到过表达Anti-PNE CAR的慢病毒载体;T细胞在本实验条件下具有良好的增殖能力和活性;过表达Anti-PNE CAR的T细胞内有高强度的绿色荧光,RT-qPCR检测显示CAR mRNA的相对表达量为对照组的1947.87±89.14倍（P<0.05）;PNE多肽干预后CAR mRNA的相对表达量增加。结论本论文成功构建了一种过表达Anti-PNE CAR的通用型CAR-T细胞,这种模块化设计的Anti-PNE CAR-T细胞可以作为一种新的免疫治疗的工具,为通用型CAR-T细胞及其安全的应用奠定基础。
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