背景喉癌的发病率占耳鼻喉恶性肿瘤的11-22%,全身恶性肿瘤的1-5%。喉鳞状细胞癌对放化疗均不敏感,在我国,治疗手段仍以手术为主。尽管治疗手段在不断提高,但患者的无病生存率及生活质量改善欠佳。手术治疗喉癌常需行气管切开术或气管造瘘术,术后患者声音嘶哑或不能发音,严重影响患者的生活质量。早期喉癌的治疗损伤性较小,尚可保留喉功能,获得较为理想的生活质量,因而喉癌的早期诊断对患者的预后意义重大。表皮生长因子受体(EGFR)、P53、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)等生物学标记物的表达与肿瘤的生长、治疗及预后有关。从分子生物学角度探讨喉癌的发生、发展机制已逐渐被关注,旨为喉癌的临床诊断、治疗方案的制定及预后的评估提供实验室依据。瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道最初在果蝇体内发现,是维持细胞膜离子平衡的主要通道,激活钙离子通道调节钙离子平衡或改变细胞膜电位,亦可通过特定的离子调控通道控制钙离子内流。TRPM通道是TRP通道的亚家族之一,其命名源于第一个家族成员melastatin (TRPM1)的发现,目前拥有八个成员：TRPM1-TRPM8。TRPM7通道广泛表达于机体各类器官及组织细胞中,参与维持细胞增殖、分化、粘附、转移及神经递质释放等多项生理活动。研究表明TRPM7还参与心血管、消化及泌尿系等多类系统疾病的病理生理活动。Nelson等下调胰腺腺癌TRPM7的表达可诱导细胞的非程序性衰老及死亡,同时还发现与吉西他滨联用可增强细胞毒性。Guilbert等证实TRPM7通道在雌激素受体阴性表达的乳腺导管腺癌中较正常乳腺组织高表达,且认为TRPM7通道是通过激酶结合域而非钙离子内流的方式参与乳腺癌细胞的转移,这将为雌激素受体阴性表达的乳腺导管腺癌的治疗提供新的生物标记物及潜在的治疗靶点。近年来,TRPM7通道与头颈肿瘤发生发展的关系正逐渐被人们重视。Chen等认为TRPM7通道以调节钙离子内流的方式参与人类鼻咽癌细胞的转移,表达下降可降低癌细胞株的生长及侵袭能力。Hanano等证实视网膜母细胞瘤(RB)细胞株可表达TRPM7通道蛋白,该通道可以自发产生阳离子电流(Ispont)及非电压门控性钙离子内流；当TRPM7表达下降时,Ispont及钙离子内流降低,细胞从G1期向S期转变减慢,减缓细胞增殖速度。Jiang等研究证实TRPM7可表达于FaDu细胞株和SCC25细胞株(两种人类头颈鳞状细胞癌细胞株),Ca2+电流与TRPM7表达水平呈正比,运用非特异性TRPM7受体阻滞剂(2-APB、Gd3+)可抑制肿瘤细胞的生长,说明TRPM7通道蛋白的表达水平与肿瘤的生长呈正相关。目的及意义目前TRPM7通道在人类喉恶性肿瘤的作用鲜有报道,运用分子生物学技术检测喉癌组织及癌旁正常黏膜组织TRPM7通道的表达水平,并对其表达的差异性进行研究分析；探讨TRPM7通道在喉癌的病理分型及淋巴结转移等组间的表达有无差异性,期望为喉鳞状细胞癌的临床诊断、靶向治疗及预后评估提供新颖的理论及实验室依据。方法1、标本的收集(1)石蜡标本筛选2013年1月至2013年10月于广东省人民医院诊断为喉鳞状细胞癌患者的石蜡组织标本,符合要求者共计18例。组织10%中性甲醛固定后,由我院病理科石蜡包埋,行苏木素-伊红染色病理确诊。(2)冰冻标本收集2013年11月至2014年2月于我院诊断为原发性喉鳞状细胞癌的患者13例,标本离体后收集癌组织及癌周正常组织,保存于无Rnase离心管中,液氮运输,-80-C超低温冰箱冻存。癌旁正常组织标本经HE染色证实未见癌细胞浸润。(3)入组患者均符合以下要求：①患者均为原发性喉癌,且全身无转移及未曾罹患其他恶性肿瘤,术后病理玻片经HE染色示鳞状细胞癌,癌旁正常黏膜组织可见排列整齐的复层鳞状细胞；②所有患者术前均未接受放射治疗或化学治疗；③患者入院均行开放性手术治疗；④癌组织标本行苏木素-伊红染色(HE染色)提示鳞状细胞癌,癌旁组织均可见正常鳞状上皮细胞。排除标准：既往有癌症史的患者或曾接受放疗、化疗或行同位素治疗的患者均不纳入研究范围。2、免疫组织化学染色石蜡切片经S-P免疫组化法染色后,光学显微镜下观察显色结果。采用Bresalier半定量公式判断染色结果,对染色结果进行半定量分析：将免疫染色玻片在10倍物镜视野下观察,随机选取5个视野,并记录其染色强度,根据染色强度分为四级,并分别计分：细胞无着色,阴性(0分)；细胞染色为浅黄色,弱阳性(1分)；细胞着色为棕黄色,阳性(2分)；细胞着色为棕褐色,强阳性(3分),计算每一强度的视野数,根据公式：染色强度=∑｛(0xF0)+(1×F1)+(2×F2)+(3xFi)),Fi=%10×视野数(i=0,1,2,3)计算每张玻片的染色强度。本实验中分别计算出患者癌组织及癌旁正常组织的染色强度,对TRPM7蛋白在喉癌及癌旁组织的表达进行定位及半定量分析。3、实时荧光定量PCR运用试剂盒提取冰冻组织的总RNA,行逆转录PCR合成cDNA,以GAPDH为内参,设计目的基因及内参基因的引物序列,运用SYBR GREEN I荧光定量PCR试剂盒及罗氏Lightcycler480Ⅱ荧光定量PCR检测仪,获得Ct值。本实验采用相对定量法,Microsoft Excle软件计算2-△△Ct分析喉鳞癌组织及癌旁正常组织TRPM7基因的相对差异。本实验适用的公式：△△Ct=(Ct目的-Ct内参)肿瘤-(Ct目的-Ct内参)正常。4、统计学分析采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。实验数据进行正态分布检测及方差齐性检测,符合正态分布的资料用均数±标准差(x±s),采用t检验对患者TRPM7通道的表达进行分析；不服从正态分布的资料用M(P25-P75)表示,采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验对患者TRPM7通道的表达情况进行分析。P<0.05被认为有统计学意义。结果1、患者全部为男性,年龄为48-75岁,石蜡包埋组织中低分化2例,中分化9例,高分化7例；淋巴结转移者5例(中分化3例,低分化2例)。冰冻组织中高分化者2例,低分化者1个,中分化者10例。2、免疫组织化学检测结果示正常喉粘膜组织及喉癌组织胞浆均可表达TRPM7通道蛋白,运用Bresalier半定量公式判断染色结果如下：经检验样本服从正态分布,肿瘤组织表达强度为7.830±2.572,癌旁组织表达强度为4.560±2.148;采用配对t检验示TRPM7通道在喉鳞癌组织及癌旁正常组织的表达差异有统计学意义(t=3.979,p=0.001)；喉癌低分化、中分化和高分化三组间TRPM7表达强度分别为10.000±2.828、8.444±2.128和6.571±2.820；经检验符合方差齐性,采用多个独立样本的t检验示表达差异无统计学意义(F=1.945,P=0.177)；两独立样本t检验分析TRPM7在癌组织的表达与淋巴结转移的关系,淋巴结转移者TRPM7的表达强度为9.400±1.140,未转移者TRPM7的表达强度为7.308±2.810,结果示淋巴结转移及未转移的患者中TRPM7蛋白的表达差异无统计学意义(t=1.591,p=0.131)。3、荧光定量PCR对TRPM7-RNA在喉癌组织及癌旁正常组织的表达进行定量分析。对ACt进行正态分布性检测得结果不服从正态分布,喉癌组织的ACt值为7.140(6.515～10.190),癌旁正常组织的ACt为7.430(6.470-8.240)。运用2-△△Ct计算法得出有2例患者(15.39%)的TRPM7表达水平在肿瘤组织较癌旁正常组织上调2倍以上；运用配对样本比较的Wilcoxon秩和检验示两组组织的表达差异无统计学意义(z=-0.664,p=0.507)。结论本研究首次证实了TRPM7通道可在人类喉癌组织及癌旁正常黏膜组织的表达,试探讨TRPM7通道在鳞癌的表达水平及意义。免疫组织化学检测证实TRPM7通道在喉鳞癌组织及癌旁正常鳞状上皮组织均可表达,表达位点为胞浆,且表达强度差异有统计学差异；但TRPM7通道蛋白在喉癌的病理分型及淋巴结有无转移的组间表达无明显相关性。新鲜冰冻组织行实时荧光定量PCR结果示喉癌组织及癌旁组织的表达水平无明显差异性,与免疫组化的结果不一致,这可能是由于RNA翻译合成蛋白质的过程中受到离子通道或其他分子机制影响或无法完全避免RNA污染、降解,及样本量较少等原因所致,因此尚不能绝对肯定TRPM7通道在两组组织的表达无差异。