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伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)能引起多种动物的发热、奇痒及脑脊髓炎。猪是PRV的贮存宿主和传染源,PRV感染猪引起伪狂犬病,导致新生仔猪出现致死性脑炎,肥育猪呼吸障碍,母猪繁殖障碍等症状。PRV属于疱疹病毒科,在全世界广泛分布。2012年,在中国北部和东部地区,猪伪狂犬病史无前例的大规模爆发,对养猪业造成巨大的经济损失。目前PRV的致病机制还不是很清楚。为进一步研究PRV感染引起的宿主细胞的基因表达变化,寻找治疗猪伪狂犬病的可能靶标,本研究利用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification,iTRAQ)技术分析了PRV感染猪肾上皮细胞(Porcine Epithelial Cells,PK15)后的全基因组蛋白表达变化,并对差异表达蛋白基因进行生物信息学分析,发现PRV感染后能够引起内质网应激反应。本实验为进一步研究PRV与宿主细胞互作提供了分子基础。1.PRV感染PK15细胞的蛋白质组学研究一步生长曲线显示,在PRV ZJ(浙江)株感染PK15细胞后24h时,病毒滴度最高。将感染后24小时的细胞裂解,提取总蛋白,iTRAQ结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法进行细胞蛋白组学分析,结果显示,鉴定的总蛋白数为4333个,其中466差异表达蛋白(差异倍数为1.5倍,P≤0.05),包括234个上调蛋白和232个下调蛋白。GO(Gene Ontology)注释结果显示在基因的分子功能(Molecular function)中,差异表达蛋白主要集中于分子结合(Binding)功能占51.11%;催化活性(Catelytic activity)占26.84%;酶活性调节(Enzyme regulator activity)占4.56%。细胞组分(Cellular component)中,差异表达蛋白主要集中于细胞部分(Cell part)占18.62%;细胞(Cell)占18.62%;细胞器(Organelle)占17.39%。参与的生物过程(Biological process)中,差异表达蛋白主要集中于细胞过程(Cellular process)占12.50%;细胞成分组织或生物发生(Cellular component organization or biogenesis)占6.78%;多细胞生物过程(Multicellular organismal process)占5.43%。COG(Cluster of Orthologous Groups of Protein)注释不同功能蛋白的结果显示,差异表达蛋白主要集中于一般功能预测(General function prediction only),蛋白数为642个;翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣(Post-translation modification,Protein turnover,Chaperones)的蛋白数为318个;翻译核糖体结构及生物过程(Translation ribosomal structure and biogenesis)的蛋白数为298个。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注释中的Pathway代谢功能类型在所有上调和下调差异蛋白中有所不同,两者Pathway功能注释结果排名前10的功能中相同的有两种,分别为代谢途径(Metabolic pathways)和不同环境中的微生物代谢(Microbial metabolism in diverse environments),相比较于下调差异蛋白的注释结果,“代谢途径”在上调差异蛋白功能注释结果中的比例略有升高。为了验证蛋白质组学的结果,我们进一步通过Western blot方法对STAT1、GRB2、PCNA、beta-catenin等差异表达蛋白进行验证,结果与蛋白质组学结果基本一致。2.PRV感染激活内质网信号通路的分子机制通路分析结果显示,PRV感染后,内质网应激蛋白通路中的21个蛋白全部上调表达,说明PRV感染后激活内质网应激反应。因此,对PRV感染后内质网应激反应通路进行研究有助于进一步了解病毒感染的宿主反应。首先,PRV感染后对其通路上的蛋白进行验证,结果显示,在PRV感染前期,GRP78、e IF2α和ATF4蛋白均上调表达,而在感染后期总体上发生下调表达。表明PRV感染后激活PERK通路,最终抑制蛋白质合成。这些蛋白质可以作为伪狂犬病毒感染细胞的潜在分子标志物,并且对PRV感染宿主细胞的调节机制也提供了新的见解。