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糖化酶(EC3.2.1.3)是属于糖苷水解家族15的一类酶，它从淀粉及其衍生物的非还原末端水解α-1，4-糖苷键，生成β葡萄糖。工业上糖化酶主要用来水解淀粉生产葡萄糖浆以及相关的产品。 我们从Thermoanaerobacter tengcongensis MB4的基因组中克隆到一个糖化酶基因TTE1813（将其编码的蛋白命名为TTeGA）。将TTeGA除去信号肽后的成熟蛋白所编码的DNA序列，插入到pET21a上，在大肠杆菌Rosetta(DE3)内获得了可溶性的表达。以ZYP-5052培养基培养自诱导表达获得了更多的ReTTeGA。重组的TTeGA最适温度高达75℃，最适pH为4.6。从SDS-PAGE和native-PAGE分析，ReTTeGA单体分子量大为77.5kD，活性形态下主要以二聚体形式存在，分子量为155KD。 重组TTeGA(ReTTeGA)在75℃温浴8h，仍然有50％以上的活力，80℃的半失活时间达2.6h。ReTTeGA水解可溶性淀粉，麦芽寡糖等许多底物，对不同底物的活力存在非常大的差异。实验条件下，它对低聚寡糖活力最高。ReTTeGA的活力不依赖于金属离子。TTeGA能完全水解1％的可溶性淀粉。 TTeGA在毕赤酵母中实现了分泌表达，在枯草芽孢杆菌中实现了胞内可溶表达。在毕赤酵母中表达的TTeGA在更宽的pH范围内有活力。而在枯草芽孢杆菌中表达的ReTTeGA的活力与最适pH与大肠杆菌中表达的情况相似。 我们模拟了TTeGA的三维结构，其结构与已经解析的来白丝状真菌，细菌的糖化酶以及模拟的古菌糖化酶进行比对。发现TTeGA的活性中心保守的氨基酸较多。催化的广义酸碱分别为Glu454，Glu652。 将TTeGA的两个结构域分开，分别在大肠杆菌中进行了表达，并分别对它们进行了酶活力的测定。发现了原核糖化酶催化结构域单独存在时，没有活力。在BD和CD共同存在时，恢复与TTeGA类似的活力，证明了BD对于TTeGA的催化作用必不可少。通过BD和CD分别单独存在条件下的热稳定性实验，发现BD是热稳定的，而CD是热不稳定的。 对TTeGA进行了逐步截短的实验，和定点突变实验，也证明BD对于TTeGA催化活性必不可少。当BD被破坏，不能形成正确的结构时，TTeGA不能形成正确的结构，并且是无活性的。因此BD可能有助于CD的折叠。截短实验和定点突变实验发现D46T47W48对于TTeGA的催化活力非常重要，证明了D46T47W48与α L1的相互作用对于催化活力的重要性。这揭示了真核糖化酶与原核糖化酶的结构差异和不同的稳定性机制。 构建了一个LIC载体pPIC9K-PmaCl，它是一个不依赖于连接酶和载体限制性酶切位点的Pichia pastoris整合分泌表达载体，可以应用于快速定向克隆和蛋白的高通量分泌表达。 克隆了Saccharomycopsis fibuligera PD70的糖化酶基因sfGA，它是一个pH在2.6-9.0均有酶活的糖化酶，最适温度为50℃。最适pH在6.2。 构建了一个TTeGA的β域和sfGA的融合蛋白，并实现分泌表达，确定它具有与sfGA相似的活性。但是活力和热稳定性与sfGA没有多少差异。这说明TTeGA的BD与CD的相互作用可能是特异性的。