目的:1.采用基于质谱检测的蛋白组学方法研究有机磷农药白蛋白加合物的法医毒物动力学规律,确定有机磷农药生前入体和死后染毒的鉴别标志物;2.采用代谢组学方法筛选并确定有机磷农药急性中毒的潜在生物标志物,对潜在生物标志物的法医毒物动力学规律进行研究,确定有机磷农药中毒的代谢组学生物标志物,为相关案件的法医学鉴定提供实验依据。方法:1.烷基膦酰基酪氨酸的合成采用羧基和氨基端有保护基的N-苄氧羰基-L-酪氨酸与苄基溴反应生成N-苄氧羰基-L-酪氨酸苯酯,再与相应结构的烷基磷酰氯反应生成N-苄氧羰基-O-(O-二烷基膦酰基)酪氨酸苯酯,最后脱去酪氨酸在羧基和氨基端的保护基,生成烷基膦酰基酪氨酸。2.有机磷农药白蛋白加合物的法医毒物动力学分别对有机磷农药急性中毒、慢性中毒和死后染毒大鼠血液进行白蛋白加合物分析,对空白血液室温放置不同时间与有机磷农药在37℃水浴中孵育24小时后检测白蛋白加合物,观察有机磷农药急性中毒大鼠白蛋白加合物在室温,4℃,-20℃和添加1%NaF室温保存条件下血液中稳定性的稳定性规律,对中毒案例血液中白蛋白加合物进行分析,验证动物实验的结果。3.代谢组学筛选确定潜在中毒生物标志物分别对毒死蜱,敌敌畏,甲胺磷,氧化乐果,甲拌磷和对硫磷急性中毒大鼠与空白对照样本的代谢物质谱图信息进行数据预处理,PCA分析,PLS-DA分析,差异化合物筛选,差异化合物鉴定等分析,得到其代谢指纹图,进一步对潜在生物标志物进行代谢通路分析并在代谢水平上阐述有机磷农药急性中毒的毒理学机制。4.潜在中毒生物标志物的法医毒物动力学选用在精氨酸和脯氨酸代谢通路上的主要代谢物肌酸及其上游代谢物乙酸胍,甘油磷脂代谢通路中上下游的代谢物l-α-磷脂酰胆碱和l-α-甘油磷酸胆碱,二硫代磷酸二乙酯,利用液相色谱串联质谱的检测方法对毒死蜱,敌敌畏,甲胺磷,氧化乐果,甲拌磷和对硫磷急性中毒大鼠和对照组大鼠血液中乙酸胍、肌酸、磷脂酰胆碱、甘油磷酸胆碱和二硫代磷酸二乙酯的含量进行分析检测,确定有机磷农药急性中毒的代谢生物标志物。结果:1.烷基膦酰基酪氨酸的合成烷基膦酰基酪氨酸的合成纯度较高,经过质谱分析二乙基膦酰酪氨酸分子量为317.1,质子化后mh+为主要离子,产物离子主要为272.1,244.0和216.0。二甲基膦酰酪氨酸分子量为290.2,质子化后mh+为主要离子,产物离子主要为228.2。二乙基硫代膦酰酪氨酸分子量为333.3,质子化后mh+为主要离子,产物离子主要为187.2,217.1,245.1和120.2,以上产物均可用于有机磷农药白蛋白加合物的法医毒物动力学研究。2.有机磷农药白蛋白加合物的法医毒物动力学敌敌畏急性中毒致死组,慢性中毒组,混合中毒实验组均检出二甲基膦酰酪氨酸;死后染毒,空白血液室温放置不同时间与敌敌畏在37℃水浴中孵育24小时的实验组中中毒案例血液放置六个月后均未检出二甲基膦酰酪氨酸;敌敌畏与白蛋白的加合物含量较低且不稳定,添加1%naf会加速其降解,常温和4℃保存12天大部分已经降解,-20℃保存可以延缓其降解;毒死蜱,甲拌磷和对硫磷急性中毒致死组,慢性中毒组,混合中毒组,大鼠死后0.5小时给药,空白血液室温放置不同时间与有机磷农药在37℃水浴中孵育24小时的实验组和中毒案例血液放置三个月均检出二乙基硫代膦酰酪氨酸;大鼠死后1小时染毒,血液中未检出二乙基硫代膦酰酪氨酸;毒死蜱,甲拌磷和对硫磷与白蛋白的加合物含量较高,-20℃保存条件下比4℃保存条件下较稳定,常温保存和添加1%naf会加速其降解。3.代谢组学筛选确定潜在中毒生物标志物通过代谢组学的研究方法筛选和确定出18种潜在的生物标志物,得到其代谢指纹图。其中,硬脂酰胺,辛胺,n,n-二甲基苯胺,神经酰胺,二乙基硫代磷酸,丙酮酸,葡萄糖酸在急性中毒的作用明显。与对照组比较,神经酰胺的浓度均降低,葡萄糖酸的浓度均升高;除甲胺磷中毒实验组外,二乙基硫代磷酸的浓度均升高;对硫磷中毒实验组外,n,n-二甲基苯胺的浓度变化均有意义。进一步对潜在生物标志物进行代谢通路分析得到11个代谢产物主要参与了包含三羧酸循环,丁酸甲酯代谢,氨基酸的生物合成和代谢,丙酮酸的代谢,糖酵解和糖异生,脂肪酸的合成、延长和代谢,嘌呤代谢等相关通路在内的16条代谢通路的过程,二乙基硫代磷酸为ops入体的一个重要标志物,丙酮酸和琥珀酸与能量代谢障碍有关,神经酰胺,磷脂酰胆碱和溶血卵磷脂与细胞凋亡有关,尿酸,葡萄糖酸与肾脏损害有关,乙酰肉碱与神经系统损害有关,从而在代谢水平上阐述有机磷农药急性中毒的毒理学机制。4.中毒生物标志物的法医毒物动力学二硫代磷酸酯可以作为甲拌磷中毒的生物标志物之一;中毒实验组血液中肌酸含量均升高,乙酸胍含量明显降低;与急性中毒实验组相比,死后1/2小时和死后1小时灌药染毒,各实验组大鼠血液中肌酸浓度均下降。急性ops中毒后,死后1/2小时和死后1小时灌药染毒实验组甘油磷酸胆碱含量与空白组相比保持不变,甘油磷酸胆碱的浓度与死亡时间无关系。与急性中毒实验组比较,死后1/2小时和死后1小时灌药各实验组磷脂酰胆碱的浓度均下降。结论:1.烷基膦酰基酪氨酸的化学合成方法可以作为ops-白蛋白加合物法医毒物动力学规律研究的对照品;血浆代谢物的lc-q-tof-ms分析方法,ops-白蛋白加合物的lc-ms-ms分析方法可以用于ops中毒生物标志物的法医毒物动力学研究;2.二甲基膦酰酪氨酸可以作为敌敌畏生前入体和死后染毒鉴别的生物标志物,但其稳定性较差,检测时限较短;二乙基硫代膦酰酪氨酸可以作为ops入体的生物标志物,但无法对甲拌磷、对硫磷及毒死蜱生前入体和死后染毒进行鉴别;3.由OPs急性中毒的代谢指纹图可得到18种潜在的生物标志物,其中11个代谢产物主要参与了体内16条代谢通路的生物学过程,导致能量代谢障碍,特别是三羧酸循环的障碍,在细胞凋亡,脂肪酸代谢和中毒反应之间存在着剂量依赖的关系,并导致肝脏、肾脏和中枢神经系统功能的紊乱;4.二硫代磷酸酯可以作为甲拌磷中毒,生前入体和死后染毒鉴别的生物标志物;肌酸、乙酸胍在血液中的水平,磷脂酰胆碱和甘油磷酸胆碱在血液中的水平可以作为OPs中毒判定的生物标志物;磷脂酰胆碱可以作为OPs生前入体和死后染毒鉴别的生物标志物。