α-半乳糖苷酶它是一种外切糖苷酶,催化含有α-半乳糖苷结构的碳水化合物水解,最初从酵母底面发酵液中提制出来。α半乳糖苷酶广泛存在于动植物和微生物中,被认为是最有应用价值的酶制剂之一。在豆类饲料中添加α-半乳糖苷酶,动物的生长性能以及其糖类的利用率均能得到提高。在食品以及医药工业等领域也具有广泛的应用前景。近年来α-半乳糖苷酶在血型的改造、异种器官的移植、法布里病等方面的研究应用前景令人振奋。通过生物信息的方法来预测酶的活性位点,再通过定点突变的方法来改造α-半乳糖苷酶,既可对其作用机制进行基础研究,也可以改良酶的作用特性,拓宽其应用领域。本文以已克隆的来源于乳球菌的α-半乳糖苷酶基因(agaH)为对象,通过生物信息分析对其活性位点进行预测,选取该酶特定的氨基酸位点进行密码子的定点突变,以及通过突变后酶活性的变化来探索底物结合中心的关键氨基酸。同源建模的方法预测了酶分子表面的pocket结构,推测其174位的天冬氨酸残基为酶活性中心关键氨基酸。通过重叠PCR的方法对该酶的编码基因进行定点突变,先后将174位氨基酸的GAC密码(编码天冬氨酸D174,极性带负电荷)突变为GGC(甘氨酸G174,极性不带电荷)和CAC(组氨酸H174,极性带正电荷)。将定点突变基因与大肠杆菌常用表达载体pET28a重组,分别构建两个突变基因的表达载体pET28a-aga(D174-G)和pET28a-aga(D174-H),以及野生对照基因的表达载体pET-28a-aga都转化大肠杆菌后BL21(DE3),利用IPT(诱导基因表达,经SDS-PAGE分析,几种诱导载体都能诱导表达预期的蛋白。采用对硝基酚的方法检测了引入了两种突变的α-半乳糖苷酶和对照组的活性大小,通过T-test检验发现这三组酶活差异不显著,底物特异性也没有发生改变。说明构成pocket结构的天冬氨酸D174对α-半乳糖苷酶的活性影响并不大,因此对于此酶的活性位点探索还需进一步的研究。