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背景多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)是一类持久性有机污染物,在全球各地环境中持续存在并可经过食物链进行生物富集和生物放大。PCBs能够通过空气、食品、水体等多种途径进入人体。PCBs在体内能够被Ⅰ相代谢酶[如细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzyme,CYP)]催化产生具有比其原型更强的生物反应活性的代谢产物并产生致突变作用。持续的PCBs暴露可导致各种健康问题,其已被国际癌症研究机构(International Agency of Research on Cancer,IARC)确认为第1类(即人类)致癌物。在CYP各亚族中,CYP2家族的底物谱广泛,对许多环境化合物具有代谢活化作用。本课题组既往研究已发现人CYP2E1可代谢活化部分低氯化的PCBs,但其对于高氯化的PCBs可否代谢活化,以及其他CYP2亚型是否参与PCBs代谢,迄今尚不清楚。此外,PCBs根据氯取代数量和位置不同有209种同系物,经典的实验研究因需要大量时间和人力成本而难以应对全部PCBs的毒性评价;而采用计算机分子模拟技术预测PCBs作为CYP2酶的底物潜能,若能对后续实验研究起到初筛作用,则可明显减少实验设计的盲目性,节省实验成本并缩短研究周期。因此,本研究利用计算机分子模拟预测PCBs对CYP酶蛋白的底物潜能及通过致突变试验进行相互印证,从而证实PCBs经特定CYP酶代谢活化的致突变作用,同时也为受试物与其活化酶的设计提供指导意义。目的1)以二噁英样(dioxin-like,DL-)多氯联苯(DL-PCBs)为例,探讨以化合物-人CYP2E1酶分子模拟预测底物潜能的结果引导相关致突变试验受试物选择的有效性;2)运用分子模拟结合实验研究探讨邻位氯取代数量对非二噁英样(non-dioxin-like,NDL-)PCBs(NDL-PCBs)与人 CYP2B6 酶相互作用的影响;3)利用既往已发表的关于包括多氯联苯在内的多种芳香族化合物经人CYP酶活化的致突变作用资料,以分子对接法分析这些受试物与相应酶蛋白的相互作用,并总结分子模拟在预测CYP酶介导化合物致突变作用上的符合度及不确定性。方法采用计算机模拟分子对接和分子动力学方法分析化学物-酶蛋白亲和性及其底物潜能;采用中国仓鼠肺成纤维(V79)细胞系、重组表达人不同CYP酶的V79衍生细胞系和人肝细胞瘤(C3A)细胞系作为受试细胞,采用脂质体法转染携带人CYP2B6序列的质粒构建V79-hCYP2B6细胞(在DNA、mRNA、蛋白质水平并以相关间接致突变物的遗传毒效应等指标对其酶蛋白及其活性进行验证),以CCK-8实验检测出的细胞活力间接反映细胞数目及细胞毒性效应,并以微核实验和Hprt致突变实验分析受试物致突变作用。对C3A细胞则采用PIG-A基因突变实验检测受试物致突变效应。结果1)采用分子模拟预测DL-PCBs作为人CYP2E1底物的可能性,结果显示2,3,3’,4,4’-五氯联苯(PCB 105)和 2,3’,4,4’,5-五氯联苯(PCB 118)符合人CYP2E1底物的条件,其余10个化合物在结合于活性中心时与辅基中亚铁离子的距离均超过6.0 A,不利于电子传递。以3,3’,4,4’-、3,4,4’,5-四氯联苯(PCB 77、PCB 81)、PCB 105、118以及3,3’,4,4’,5-五氯联苯(PCB 126)为受试物,微核实验(6 h暴露/18 h恢复)结果显示PCB 105和PCB 118均明显诱发V79-hCYP2E1细胞微核形成,且该效应被1-氨基苯并三唑(CYP抑制剂)明显抑制或完全阻断;V79-Mz对照细胞则对二者呈阴性(PCB 118)或弱阳性(PCB 105)反应。相反,PCB 77、PCB 81和PCB 126对两种细胞均无诱导微核作用。PCB 105和PCB 118对C3A细胞也诱发微核形成,且诱导PIG-A基因突变;这两种效应都被反式1,2-二氯乙烯(选择性CYP2E1抑制剂)所阻断。2)采用分子模拟分析含不同数目邻位氯取代基的2,2’,3,3’-、2,2’,3,6’-、2,2’,6,6’-以及 2,3,3’,4’-四氯联苯(PCB 40、PCB 46、PCB 54 及 PCB 56)与人CYP2B6的相互作用,结果提示它们都有人CYP2B6的底物潜能。随后以基因转染方法构建稳定表达人CYP2B6酶的V79重组细胞系(V79-hCYP2B6),其蛋白表达与对已知前致突变物黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)反应均呈现阳性(而其母细胞系V79-Mz为阴性反应),故将其用于后续实验。结果表明,四个受试物在不同暴露条件下对V79-Mz细胞均有轻微的细胞毒作用(处理组细胞数约为对照组的80%),但是对V79-hCYP2B6细胞其细胞毒性作用减弱或消失,甚至出现细胞增殖加快(提示有代谢减毒可能)。然而微核实验显示,PCB 56于40 μmol/L对V79-Mz细胞具有诱发微核作用,但对V79-hCYP2B6细胞则无作用;而其他三个受试物对两种受试细胞均无诱发微核作用。鉴于以上受试物本身未呈现代谢激活的遗传毒作用,本研究进一步分析其对已知可由CYP2B6酶活化的重要致癌、致突变物AFB1诱发遗传毒作用的影响;结果表明,AFB1对V79-hCYP2B6细胞明显诱发微核形成,且该效应被PCB46、PCB 54和PCB 56抑制,但不受PCB 40影响。通过PCB 56与人CYP2E1和CYP2B6活性中心结合所呈现构象的比较,其羟化位置可能不同,提示代谢产物结构有异,这或可部分解释本研究关于PCB 56的结果与其经人CYP2E1酶活化呈强致突变作用的既往发现大相径庭的现象。3)采用分子对接预测部分已有实验研究结论的芳香族化合物对相关CYP酶的底物潜能,结果显示分子对接和实验研究结果有着较高的一致性。但针对CYP2E1蛋白需要设置柔性残基如PHE478,以适应一些分子相对大的底物(如PCBs、1-甲基芘等)对活性中心空间的需求。总结PCBs与CYP酶对接结果与已报道的相关毒性实验数据(主要由本研究团队完成)的一致性,发现在47个被测试的化合物中,代谢激活毒性的实验结果(阳性或阴性)与分子对接发现相一致者有36例,占76.7%。结论1)对于一些PCBs化合物,例如DL-PCBs,其分子模拟预测作为人CYP2E1酶底物潜能与致突变实验数据明显相符,提示分子模拟有希望作为化合物代谢激活的遗传毒性测试的初筛方法。2)对于另一些化合物,例如含不同数目邻位氯取代基的NDL-PCBs,与人CYP2B6按分子模拟的底物预测结果(阳性)未得到相关微核试验结果(阴性)的支持;进一步研究结果支持其中多数受试物与人CYP2B6的结合(由其抑制AFB1依赖该酶的微核形成作用而判定),提示PCBs与CYP酶在代谢活化之外还可能仅仅发生相互结合或产生代谢减毒作用。3)依据多苯环化合物(1-MP)经人CYP2E1代谢活化的已确认证据,由于人CYP2E1具有明显狭小的活性中心,PHE478残基的柔性设置至关重要;在此基础上对已证实化合物-CYP酶是否具有代谢作用的的芳香族化合物进行分子对接,其结果与实验研究数据大部分相符,因此分子模拟作为受试物基于CYP酶代谢活化的遗传毒性研究的筛试手段,值得在应用中进一步探讨。