胆汁酸(Bile Acid,BA)是胆汁的重要成分,分为游离胆汁酸和结合胆汁酸,在肠肝循环系统内通过再循环对人体起重要的保护作用。甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)是胆汁酸的主要成分之一,是胆酸与甘氨酸在肝内结合而成的结合型胆汁酸,在胆管癌、总胆管结石、肝内胆汁淤积症、肝硬化、良性胆道疾病、胰腺癌等[1-5]疾病的临床诊断和疾病观察中具有重要的意义。目前,已有多种检验方法用于甘氨胆酸的检测,但不同检测方法或是不同实验室可造成测定同一份标本得到的结果存在不同程度的差异,准确性、可靠性及可比性较差,从而直接影响到疾病的诊断、治疗和疗效的观察。因此,要想实现GCA检验结果的可比性和准确性,进行标准化研究势在必行。标准化研究的核心是实现测定结果的溯源,而具备参考系统是开展检验量值溯源链的必要条件[6-10],其中,参考系统包括参考实验室、参考方法和参考物质。量值溯源的理想情况是溯源至国际单位制(SI),其实现手段主要包括有:(1)直接送至有资质的鉴定/校准机构进行检定和校准;(2)实验室建立相应的参考方法;(3)使用有证参考物质(CRM);(4)当溯源至国家标准不可能或不适用时,应溯源至公认实物标准品等,或通过比对实验、参加能力验证等途径实现溯源[11]。但目前尚无国际约定的GCA参考测量程序(参考方法),也尚无有证参考物质,因此,准确、可靠的参考方法的建立是达到溯源效果,解决测量结果正确性问题和实现检验结果标准化的有效途径。针对此现象,本文将先进的同位素稀释液相色谱-串联质谱(ID-LC-MS/MS)联用技术应用于人血清GCA的检测中,使用括号法定量,分别对质谱条件、色谱条件、前处理条件进行全面优化,建立GCA检测的候选参考方法,对该方法学进行系统的性能评价。同时,利用建立的候选参考方法对现行的常规检测方法进行比对和评价,旨在为GCA检测结果的标准化提供依据和参考。目的:对同位素稀释液相色谱-串联质谱法(ID-LC-MS/MS)测定血清GCA的质谱条件、色谱条件、前处理方法等各项检测条件进行优化,建立能够准确、精密测定GCA的候选参考方法。评价ID-LC-MS/MS检测GCA候选参考方法的各项性能是否满足要求,并应用建立的候选参考方法对常规检测方法进行比对和评价。方法:在活性炭吸附血清中加入已知浓度值和含量的甘氨胆酸标准品GCA和内标物甘氨胆酸-2,2,4,4-d4,使用Waters TQ-S三重四级杆液相色谱串联质谱仪对GCA的前处理条件(前处理方式)、质谱条件(检测模式、离子源、离子对、离子模式、化合物及气体参数)和色谱条件(流动相、洗脱模式、流速、柱温、进样量)等进行全面考察和系统优化。根据美国临床和实验室标准化协会(CLIS)系列文件对初步建立的GCA候选参考方法的精密度、正确度、特异性、分析灵敏度、线性范围、干扰、基质效应、携带污染等性能进行评估和验证,并对方法建立与性能评价过程中的样本的稳定性及不确定度进行评价。应用建立的候选参考方法与现行临床常规检测方法进行比对,并进行方法学之间的评估。结果:质谱条件:利用电喷雾负离子(ESI-)和多反应监测(MRM)模式检测实验样本,在调整和优化各项检测参数后分别获得了样本GCA和内标GCA-d4的定性和定量离子对:样本GCA的离子对质荷比(m/z)为464.4→74.0(定量)和m/z 464.4→402.2(定性);对应的内标离子对的质荷比为m/z 468.4→74.0(定量)和m/z 468.4→406.1(定性)。色谱条件:色谱条件的优化选用了 ACQUITY UPLC(?)BEH C18色谱柱(1.7 um,2.1×100 mm),乙腈为有机相,水相为0.2 mmol/L乙酸铵溶液(流动相中加入0.5%甲酸);流速设为0.4 mL/min;梯度模式5 min洗脱。前处理条件:无水乙醇为蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀,蛋白沉淀效率可达76.1±2.3%(n=6);实验过程中未发现离子抑制现象;样本平衡时间选择0.5h。方法性能:在0.2-20 μ g/mL样本浓度范围内,低中高三个浓度水平样本的批内精密度分别为1.39%,1.01%和0.46%;批间精密度分别为2.01%,1.24%和0.84%;三个浓度水平的样本总不精密度均低于2.14%。标准品GCA的回收率在98.0%-100.9%之间,回收率良好,正确度符合要求;最低检测限(LLOD)为0.01 ng/mL,最低定量限(LLOQ)为0.05 ng/mL;线性范围为0.039 μ g/mL-40 μ g/mL;选取的8种结构类似物在现有检测条件下无响应,方法特异性良好;血红蛋白6.1 mg/mL,胆红素0.2 mg/mL,甘油三酯2.5 mg/mL对GCA的检测和定量无明显干扰;方法携带污染率小于1.0%,不存在携带污染;血清基质对样本检测未发现明显的基质效应。初步建立的方法用于样本测定的结果显示,样本可在不同储存条件下保存一定的时间,稳定性良好。对方法的不确定来源进行评估,求得其合成不确定度并评定相对扩展不确定度可知,方法的相对扩展不确定度小于2.7%,在可接受范围内,符合评判要求。方法应用:将现行常规方法与候选参考方法进行方法学比对,数据分析可得两种方法学之间的检测结果均存在正偏倚,相关性小于0.99,可比性和一致性较差。因此,具有高精密度、高特异性等特点的参考方法的建立可在某种程度上加大GCA检测结果的可信度,促进标准化的实现。结论:本研究对前处理条件、质谱条件、色谱条件进行充分研究和系统优化,初步提出和建立的GCA测量同位素液相色谱串联质谱法原理可靠,具有优异的正确度和精密度,特异性和灵敏度良好,具有较宽的线性范围,抗干扰能力强,无基质效应和携带污染,可作为GCA的候选参考方法。且该研究样本稳定性良好,方法满足最小不确定度的要求,可为常规检测结果的标准化提供一定的依据和参考。ID-LC-MS/MS技术检测GCA参考方法的建立为GCA测定的准确性、一致性和标准化提供了可靠的技术支持,有望为临床肝胆疾病的诊治提供有效依据!