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目的色素沉着绒毛结节性滑膜炎（pigmented villonodular synovitis,PVNS）是一种关节滑膜、滑囊和腱鞘的增殖性疾病,以滑膜高度增生、绒毛及结节形成和棕色含铁血黄素沉着为其特点,对关节组织具有明显的侵袭性,传统治疗方法包括手术治疗和放疗等疗效差,易复发。基因治疗,尤其是自杀基因疗法越来越多被应用到临床研究中,其中疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidinekinase,HSV—TK）基因转染结合抗病毒药更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）是最常用的自杀基因系统之一。本课题是利用自杀基因选择性作用于增殖活跃细胞的机理,观察腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎增殖活跃的滑膜细胞的作用,探求HSV—TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎的疗效,以探索一条有效的基因治疗途径。材料与方法1带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组腺病毒购自本元正阳公司,于我院中心实验室保存,Ad-TK滴度为3.2×1011pfu/ml。GCV购自湖北科益药业有限公司。2取色素沉着绒毛结节滑膜炎患者滑膜组织,按Goto方法分离并传代培养。倒置相差显微镜观察细胞生长情况。取第三代滑膜细胞接种于24孔板,分别加入不同滴度的Ad-TK,第1孔加入PBS进行空白对照,感染24h。荧光显微镜下计数表达GFP的细胞百分率来测定细胞的感染效率,绘制感染效率曲线。3取1×104个待测细胞,提取总的DNA,以HSV1基因组DNA为模板进行PCR扩增,以检测HSV-tk的表达。4将第三代滑膜细胞接种于96孔板,以MOI为120的AD-TK转染滑膜细胞,并以未转染滑膜细胞作为对照,24小时后分别加入不同浓度的GCV（0.01、0.1、1、10和100 ug/mL）,48小时后MTT法检测光吸收值,按以下公式测定细胞的存活率:存活率（%）=（实验孔A值/对照孔A值）×100%,绘制存活率曲线。5用MOI为120的Ad-tk转染滑膜细胞,24h后,将转染HSV-TK基因滑膜细胞（TK+细胞）与未转染HSV-TK基因细胞（TK-细胞）分别以不同比例（0,10%,25%,50%,75%,100%）混合,接种于96孔板,培养24h后,加入GCV10μg/ml的培养液,4d后,用MTT法计算细胞杀伤率,观察旁观者效应。6用MOI为120的Ad-tk转染滑膜细胞,24h后加入10μg/mlGCV,于12h、24h、48h分别置倒置显微镜下观察细胞形态变化;48h后用Hoechst33342/PI染色、固定,将细胞悬液滴在载玻片上,加盖玻片,用荧光显微镜观察、计数。7用MOI为120的Ad-tk转染滑膜细胞,24小时后加入GCV10μg/ml的培养液培养48小时,消化、离心、回收所有细胞,加入Annexin V FITC及PI,流式细胞仪上机检测。结果1滑膜细胞贴壁后,镜下主要可见两种类型的细胞,即巨噬细胞样细胞（MCs）和成纤维细胞样细胞（FCs）。当培养到第三代时,FCs占较大比例。细胞呈梭形,增殖活跃。转染腺病毒的滑膜细胞,表达GFP;MOI为120以上时,转染率可达100%。2 PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳显示,Ad-tk转染滑膜细胞后,可见长为1.13kb大小的特异性条带,而对照组则未见相关条带,表明HSV—TK基因已经整合到基因组中。3 Ad-tk/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用:用MOI为120的Ad-tk转染的滑膜细胞,加入不同浓度的GCV后,随着GCV浓度的增加,细胞的存活率逐渐减少,GCV对转染滑膜细胞呈现明显的剂量依赖性,10 ug/ml GCV杀伤80%,而100ug/ml GCV对未转染细胞仍无明显杀伤作用,说明Ad-tk/GCV系统对滑膜细胞具有明显的抑制作用。4转染HSV-TK基因滑膜细胞（TK+细胞）与未转染HSV-TK基因细胞（TK-细胞）分别以不同比例混合后,加入10 ug/m1 GCV,随着TK+细胞比例的增加,存活率进一步减低,当TK+细胞占75%时,混合细胞几乎全部死亡,表明该系统存在明显的旁观者效应。5滑膜细胞经HSV-TK/GCV系统作用后,倒置相差显微镜观察发现细胞由梭形转变为圆形,胞浆内出现空泡改变;24h后细胞开始萎缩,细胞核变得模糊不清;48h后部分细胞裂解为碎片。HSV-TK/GCV系统处理的滑膜细胞,用Hoechst33342/PI双染色后有三种细胞状态,分别为:正常细胞蓝色淡染,凋亡细胞为浓染或成颗粒状,坏死细胞为红色。6转染HSV-TK基因的滑膜细胞,并给予GCV作用48小时后,细胞出现明显的坏死和凋亡,坏死和凋亡比例分别为58.7%和23.4%,对照组无明显的坏死和凋亡。结论1含HSV-TK基因的重组腺病毒载体对体外培养PVNS滑膜细胞具有较高的转染效率。2 HSV-TK/GCV系统对体外培养的色素沉着绒毛结节滑膜炎滑膜细胞具有抑制作用,在一定范围内GCV有浓度依赖性,且存在旁观者效应。3细胞经HSV-TK/GCV系统作用后形态学发生变化:细胞变形、结构改变,最后死亡;双染色后荧光显微镜见细胞有坏死和凋亡。4流式细胞仪证实HSV-TK/GCV系统对体外培养PVNS滑膜细胞有明显抑制作用,坏死率高于凋亡率。