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肺癌(lung cancer,LC)在全球肿瘤相关死亡原因中占据首位,是我国的第四大主要死亡原因。小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)分别占肺癌的15%~20%和80%。SCLC是一种伴随肿瘤生长迅速和转移、易出现耐药、恶性程度高并致命的肺癌。尽管SCLC患者发病早期对放化疗敏感,但大多数患者容易在治疗后的6个月内病情恶化,5年生存率仅有10%。因此,急需寻找一个新型有效并特定治疗SCLC的方法。旋毛形线虫(Trichinella spiralis,T.s)是一种寄生性线虫,可感染包括人类在内的几乎所有哺乳动物,引起人兽共患旋毛虫病。人类认识到旋毛虫的危害并进行防控的同时,有学者研究发现,旋毛虫在动物体内寄生可以抑制肿瘤生长,体外实验证实旋毛虫的活性蛋白有抑制肿瘤细胞增殖的作用,这为肿瘤生物治疗的研究提供了一个新方向。本实验的研究对象旋毛虫肌幼虫虫体蛋白是通过虫体粗提取的一种抗原成分,目前尚未见有文献报道该蛋白能否对小细胞肺癌生长产生抑制作用。本课题拟以人小细胞肺癌H446细胞作为研究对象,观察旋毛虫肌幼虫虫体蛋白是否可诱导其凋亡,并进一步探讨作用机制。目的:本实验研究旋毛虫肌幼虫虫体蛋白对小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响,探讨旋毛虫肌幼虫虫体蛋白诱导小细胞肺癌H446细胞凋亡的作用机制,为肿瘤生物制剂的研发提供新的思路和实验依据。方法:1.MTT法检测H446细胞的增殖活性对实验进行分组,实验组:将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的虫体蛋白分别与H446细胞培养24h、48h和72h;空白对照组:H446细胞不加任何处理。通过MTT法检测不同浓度的虫体蛋白对H446细胞增殖活性的影响。2.PI染色法检测H446细胞的周期阻滞作用将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的虫体蛋白分别与H446细胞培养24h,空白对照组不加处理,收集细胞进行PI染色,检测H446细胞的周期分布,比较实验组和空白对照组之间有无明显差异。3.Annexin V-FITC/PI双染法检测H446细胞的凋亡率将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的虫体蛋白分别与H446细胞培养24h,空白对照组不加处理,收集细胞进行Annexin V-FITC/PI双染,检测H446细胞的凋亡率,比较实验组和空白对照组之间有无明显差异。4.免疫荧光法检测H446细胞中Caspase-9的表达将0.8mg/mL虫体蛋白与H446细胞培养24h,空白对照组不加处理,经过细胞固定、破膜、封闭、加Caspase-9抗体、加二抗、封片等过程,荧光显微镜下采取图片。5.Real-time PCR方法检测H446细胞凋亡因子的mRNA转录水平将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的虫体蛋白分别与H446细胞培养24h,空白对照组不加处理,提取核酸检测Bax、Bcl-2、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9及Caspase-3 mRNA的转录水平。6.蛋白印迹(Western Blot)检测H446细胞凋亡因子的蛋白表达水平将0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL虫体蛋白分别与H446细胞培养24h,空白对照组不加处理,提取细胞总蛋白检测Bax、Bcl-2、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达水平。7.统计学分析使用SPSS19.0统计学软件包对本实验的所有数据进行分析。采用单因素方差检验对数据进行分析。以P﹤0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.MTT法检测H446细胞增殖活性情况MTT结果显示,不同浓度(0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL)的虫体蛋白分别与H446细胞共培养24h、48h及72h后,与空白对照组相比,H446细胞增殖活性受到明显的抑制(P﹤0.05),并呈现剂量-时间依赖性。2.PI染色法检测H446细胞周期PI染色结果显示,虫体蛋白将H446细胞阻滞于G0/G1期,0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的旋毛虫肌幼虫虫体蛋白作用于H446细胞24h后,G0/G1期所占的比例分别为(46.66±0.38)%、(55.64±0.93)%、(58.63±0.47)%,空白对照组为(44.23±1.7)%;S期所占比例分别为(46.55±1.17)%、(43.75±1.49)%、(33.72±2.24)%,空白对照组(47.34±1.11)%。G0/G1期细胞所占比例,0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL虫体蛋白组均高于空白对照组(P﹤0.05);S期细胞所占比例,0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL虫体蛋白组均低于空白对照组(P﹤0.05),均呈现剂量依赖性。3.Annexin V-FITC/PI双染法检测H446细胞的凋亡率Annexin V-FITC/PI双染结果显示,不同浓度的虫体蛋白(0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL)作用于H446细胞24h后,能够诱导H446细胞凋亡,并以晚期凋亡为主,晚期凋亡率分别为(8.13±0.14)%、(10.7±1.60)%、(22.63±1.52)%,空白对照组为(3.89±0.47)%,实验组的H446细胞晚期凋亡率均高于空白对照组(P﹤0.05),并呈剂量依赖性。4.免疫荧光检测H446细胞的Caspase-9的表达免疫荧光结果显示,0.8mg/mL虫体蛋白作用于H446细胞24h后,H446细胞中Caspase-9呈现绿色荧光,而空白对照组的荧光强度不明显,DAPI染色为亮蓝色,强度高于空白对照组,通过荧光定位提示,Caspase-9在细胞浆和细胞核中均有表达。5.Real-time PCR检测线粒体凋亡相关因子的mRNA转录水平Real-time PCR检测结果显示,与空白对照组相比,0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL虫体蛋白组的Bax、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9及Caspase-3 mRNA的转录水平呈上调趋势,而Bcl-2 mRNA的转录水平呈下调趋势(P﹤0.05),差异具有统计学意义。6.蛋白印迹(Western Blot)检测线粒体凋亡相关因子的蛋白表达情况Western Blot检测结果显示,与空白对照组相比,0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的虫体蛋白Bax、Cyt-C、Apaf-1、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达呈上调趋势,而Bcl-2蛋白的表达呈下调趋势(P﹤0.05),差异具有统计学意义。结论:1.旋毛虫肌幼虫虫体蛋白具有抑制小细胞肺癌H446细胞增殖的作用,并可以诱导细胞凋亡。2.旋毛虫肌幼虫虫体蛋白可能通过线粒体凋亡的内源性途径,以Caspase依赖性的方式诱导H446细胞凋亡。