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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSF virus,CSFV)引起的猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病,其临床特征为发病急、高热稽留和细小血管壁变性,从而引起全身泛发性小点出血和脾脏梗死的典型症状。CSF被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)列为法定报告疫病,在我国被列为一类传染病,对养猪业危害巨大。疫苗接种是目前防控CSF感染最有效和最经济的手段。目前我国临床应用的CSF疫苗毒种均为C株疫苗毒制备,根据不同工艺可分为CSF活疫苗(脾淋源)、CSF活疫苗(乳兔源)、CSF活疫苗(细胞源)、CSF活疫苗(传代细胞源),其中CSF活疫苗(传代细胞源)被广泛应用。抗原生产是疫苗制造的关键环节,抗原含量及免疫原性是决定疫苗质量的关键因素。目前国内生产疫苗抗原主要采用传统的转瓶工艺,但是该工艺生产中存在易污染、批间差异大的缺陷。建立以生物反应器为基础的微载体悬浮培养技术将是动物疫苗生产的主流趋势。基于此,本研究对利用牛睾丸传代细胞(Bovine testicular passage cells,BT)微载体悬浮培养技术生产CSF活疫苗的关键工艺参数进行优化,并对利用该工艺生产的3批次实验制品的安全性、免疫效力的质量进行评价,为采用BT细胞微载体悬浮培养技术生产安全、低成本、高效的猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)奠定技术基础。1.BT细胞微载体悬浮培养CSFV的增殖工艺研究本研究对微载体悬浮培养BT细胞的生长条件及CSFV的增殖条件进行研究,确定其关键参数为:细胞接种密度为1.5×105个/mg～2.0×105个/mg,搅拌转速为40～45 rpm(2L生物反应器)、45～50 rpm(10L生物反应器),感染复数(Multiplicity ofinfection,MOI)为0.1～0.5,接种后第5d第一次收获病毒液并更换维持液,以后每隔4d收获病毒液并更换维持液,可连续收获8次,CSFV抗原平均含量达到107.2 FAID50/mL以上。2.BT细胞微载体悬浮培养生产猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)实验室制品的成品检验对利用BT细胞微载体悬浮培养制备的3批次猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)试制品进行成品检验,结果显示,3个批次实验室制品的病毒含量分别为105.0、104.9、105.1 FAID50/头份,每头份剂量为7500兔体感染量(RID);性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、剩余水分检验和真空度检验结果均符合《猪瘟活疫苗制造及检验规程(Ⅱ)》质量标准要求。3.BT细胞微载体悬浮培养生产猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)实验室制品的安全性检验为评价采用微载体悬浮培养工艺生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)的安全性,本研究采用实验室试制的3批次疫苗(批次分别为:CSFXF001、CSFXF002、CSFXF003),选择4-6周龄CSF抗体阴性健康仔猪,对15头单剂量接种(1头份/头)、对15头单剂量重复接种(2次接种间隔14 d),同时设阴性对照组;选择4～6周龄不同品种的CSF抗体阴性健康仔猪(长白、大白、杜洛克),对15头进行超剂量接种(30头份/头),设阴性对照组;选择2周龄CSF抗体阴性健康仔猪,对15头超剂量(30头份/头)接种,设阴性对照组;选择妊娠前期(妊娠20～30 d)、中期(妊娠50～70 d)、后期(妊娠80～95 d)的母猪各10头,分别5头超剂量(30头份/头)接种,5头做为阴性对照组。结果显示,实验室试制的3批次猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)对CSF抗体阴性健康仔猪单剂量单次接种、单剂量重复接种、对不同品种仔猪超剂量接种以及对2周龄日龄仔猪超剂量接种,免疫组和对照组仔猪的体温均在正常范围之内、动物精神状态及食欲良好,未见不良反应,疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状。对妊娠前、中、后期母猪超剂量接种,免疫组和对照组母猪精神状态及食欲均良好,均未流产,未见临床不良反应,断奶后仔猪平均成活率达97%以上,免疫组仔猪与对照组仔猪从出生到断奶体重增重无差异。4.BT细胞微载体悬浮培养生产猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)实验室制品效力检验为评价采用BT细胞微载体悬浮培养工艺生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)的免疫效力,本研究对试制的CSFXF001批产品,分别按105.0 FAID50/头、101.5 FAID50/头、100.5 FAID50/头免疫4-6周龄CSF抗体阴性健康仔猪,每组5头,设阴性对照组,免疫后14 d攻击检验用强毒CSFV石门系血毒1 mL,观察16 d,确定CSF活疫苗的最小免疫剂量;将CSFXF002批产品与市售同类制品CSF活疫苗(转瓶工艺传代细胞源C株)产品,按101.5 FAID50/头免疫4-6周龄CSF抗体阴性健康仔猪,每组5头,设阴性对照,免疫后14 d攻击检验用强毒CSFV石门系血毒1 mL,观察16 d后对比两种工艺的产品免疫保护效果;将CSFXF003批产品,按1头份/头免疫4-6周龄CSF抗体阳性健康仔猪10头,同时设CSF母源抗体阳性对照组和CSF抗体阴性对照组,免疫后14 d攻击检验用强毒CSFV石门系血毒1 mL,观察16 d后统计各组保护情况,分析CSF母源抗体对疫苗免疫的干扰。试验结果显示猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)的最小免疫剂量为100.5FAID50/头份;悬浮工艺与传统转瓶细胞传代工艺生产的CSF活疫苗免疫攻毒后,免疫组均5/5保护,对照组5/5死亡,说明两种工艺生产的CSF活疫苗免疫效果无差异;携带母源抗体的免疫组实验动物10/10保护,未免疫疫苗的CSF母源抗体阳性组5/10保护,CSF抗体阴性对照组实验动物5/5发病,5/5死亡,说明猪瘟活疫苗(传代细胞源C株)可以突破母源抗体,对实验动物起到良好的保护效果。结果表明,采用BT细胞微载体悬浮培养技术生产猪瘟活疫苗(传代细胞源C株),批间稳定,抗原含量及免疫原性好,安全、有效,为后续的CSF活疫苗的悬浮工艺研究提供技术参考。