研究背景:　　 恶性肿瘤在本世纪及未来的一段时期内仍将是严重威胁人类健康的重要疾病。在我国大中城市和西方国家，肺癌的发病率和死亡率仍居各种恶性肿瘤的首位。据WHO统计，全世界每年估计有超过120万新发肺癌患者，死亡约110万人。但就肺癌而言80％患者发现已属中晚期，5年平均生存率仅有20％。国际上目前在肿瘤的基础研究领域已取得了许多实质性的成果，但临床工作中尚缺乏能有效筛查，随访和判断预后的肿瘤分子生物学标志物，肿瘤的免疫逃逸机制尚不确定。　　 肿瘤的发生、发展及免疫逃逸与机体免疫机能密切相关。机体免疫机能的有效执行则是建立于淋巴细胞各亚群之间比例关系及功能正常的前提基础上。因此淋巴细胞是肿瘤间质中是最重要的细胞，与患者病情进展和预后密切相关，其活性和功能发生相应改变，导致了疾病进展和预后向着完全相反的转归。因此可望通过恢复其所具有的主动调控癌细胞生存和转移能力，从而达到“重建”抗肿瘤免疫功能。　　 研究目的:　　 1、探讨超低温冰冻保存组织行石蜡包埋后行免疫组化染色的可行性及实验方法的探索。　　 2、利用已制备肿瘤及瘤旁组织石蜡模块进行T淋巴细胞各亚群免疫组化染色，探讨癌症分期与肿瘤微环境内T淋巴细胞亚群改变的关联性。　　 3、探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)增殖与癌细胞免疫逃逸的关系。　　 实验对象和方法　　 一、实验对象：　　 我院2009年5月至11月间60例经术后病理确诊为非小细胞肺癌患者的新鲜肿瘤组织及瘤旁组织标本。其中男性32例，女性28例，年龄47岁～77岁，中位年龄62岁。术后按1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的肺癌TNM分期标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。术前均未接受过化、放疗。术中取材包括无明显出血坏死的肿瘤组织，及肉眼可辨邻近肿瘤的正常肺组织作为瘤旁组织。　　 二、肺癌病人组织取材及保存：　　 术中瘤体离体后30min内，取瘤体及瘤旁组织各一块，直径约1×1cm，剔除坏死组织及血凝块后，予以-196℃液氮速冻后转入-80℃冰箱恒温保存。　　 三、冰冻组织的石蜡模块构建：　　 冰冻组织依特定条件梯度复温后置入多聚甲醛溶液中，常规脱水，透明后石蜡包埋1.5×1.5cm蜡块。　　 四、组织切片及免疫组化染色：　　 将每个肿瘤及瘤旁组织标本切取4μm厚白片4张，其中两张为连续切片，分别行CD3、CD8，连续切片行CD4及CD25/Foxp3染色。每个癌旁组织连续切片2张行CD4及CD25/Foxp3染色。　　 五、阳性目标细胞的判读及统计学分析：　　 CD3+、CD4+、CD8+T细胞判断标准:细胞形态完整，结构清晰，棕黄色颗粒特异定位于胞膜上。CD25+Foxp3+T细胞判断标准：细胞形态完整，结构清晰，代表Foxp3+红色颗粒定位于胞内，代表CD25+棕黄色颗粒定位于胞膜上。CD4+CD25+Foxp3+T细胞以两张连续切片，在相同部位出现CD4+、CD25+、Foxp3+三阳性标记的细胞为目标细胞，采用先在低倍镜(×100倍)下观察整张切片，随机选择5个高倍视野(400倍)，运用Imageproplus软件设定AOI(Area of interest)后，计数阳性细胞数，以均数±标准差表示，输入采用SPSS14.0统计软件进行t检验、Spearman秩相关分析，交叉分类2×2列联表的关联分析，检验水准取α=0.05。　　 实验结果:　　 1.超低温冰冻保存组织行石蜡包埋免疫组化染色：　　 临床收集手术标本，-196℃液氮速冻后转入-80℃冰箱恒温保存，其中组织标本最长冰冻时间为7个月。经过梯度降温及多聚甲醛浸泡脱水后，按常规石蜡切片制作，HE染色组织形态结构完整，膜抗原无明显破坏，免疫组化染色与新鲜组织石蜡切片比较无明显差别。　　 2.肿瘤组织微环境T淋巴细胞亚群活性：　　 Ⅰ/Ⅱ期患者为A组，Ⅲ/Ⅳ期患者为B组，两组非小细胞肺癌患者肿瘤组织中T淋巴细胞绝对值差异有统计学意义(P＜0.05)。B组较之A组CD4淋巴细胞亚群数目下降、CD4/CD8比值下降(P＜0.05)，Treg亚群细胞数目、CD8淋巴亚群细胞数目升高。　　 3.CD4+CD25+Foxp3+与肿瘤分期相关性统计学分析：　　 Spearman秩相关检验，相关系数rs=0.53，查rs临界值表，r0.05，60=0.255，｜rs｜＞r0.05，60(P＜0.05)，提示肿瘤分期与CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例呈正相关。　　 结论:　　 1.证实了临床工作中经液氮速冻后-80℃冰箱恒温长期保存的组织行石蜡切片免疫组化染色实验方法的可行性。且对具体实验方法进行了新的探索与改进，使抗原保护更优，组织结构形态保存更完整。　　 2.随着肿瘤的发生发展，起辅助/诱导T淋巴细胞亚群CD4 T淋巴细胞数目下降，而起免疫抑制的作用的CD8 T淋巴细胞数目上升。　　 3.CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数目及比例与肿瘤的分期成正相关，且癌周组织较之癌旁组织观察到明显的调节性T细胞聚集，导致了局部肿瘤免疫无能及肿瘤细胞的逃逸