研究背景： 卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。由于缺乏有效的早期筛查手段，2/3以上的卵巢癌患者就诊时已届晚期，其5年生存率仅为20％～30％，而早期卵巢癌患者的5年生存率可达90％。卵巢癌发病隐匿，进展迅速，虽然近20年来在卵巢癌治疗方面取得了长足进展，卵巢癌手术技巧不断提高，新型化疗药物、化疗方案亦陆续投入临床使用，但这些传统的治疗手段均未能显著改善患者的长期生存率。局部浸润与转移是关系到卵巢癌临床治疗成败的关键，而侵袭转移又是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程。因此研究卵巢癌侵袭转移机制及主要调控因素意义重大，可以为临床治疗提供新思路和分子治疗的靶点。 溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是新近发现的具有生长因子样作用的脂类小分子物质，主要通过与其特异性G蛋白偶联受体结合发挥多种生物学作用，诱导多种细胞发生增生性和形态学改变。许多晚期肿瘤患者的腹水中都可检测到高水平的LPA。在卵巢癌，研究显示LPA不仅存在于晚期患者的腹水，在早期患者的血浆中也可检测到LPA水平升高，且其特异性和敏感性明显高于CA125。近年发现LPA及其受体信号通路在许多恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中发挥重要作用，如甲状腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌等。现已知的LPA受体有5种，LPA1/EDG2、 LPA2/EDG4、LPA3/EDG7，以及最近识别的LPA4/GPR23/p2y9和LPA5/PPARγ。LPA通过与这些受体结合刺激肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭、迁移及侵袭相关细胞因子的分泌。体外研究显示：LPA1在正常和永生化的卵巢表面上皮细胞中高表达，而LPA2/EDG4，LPA3/EDG7在卵巢癌组织和癌细胞系中高表达，提示LPA受体有望成为卵巢癌治疗的新靶点。 尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator，uPA)是降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)最重要的酶类之一，它在肿瘤细胞侵袭和转移中的作用已被证实。uPA与卵巢、乳腺和结肠细胞的恶性转化有关。在卵巢癌，细胞内uPA的水平与卵巢癌的预后呈负相关。与其他癌症相比，uPA在卵巢癌组织和腹水中明显的高表达。 uPA既可通过催化纤溶酶原转化成纤溶酶导致基底膜的降解，从而加速癌细胞的侵袭和转移，也可通过与其特异性受体(urokinase plasminogen activatorreceptor，uPAR)结合刺激细胞的迁移和增殖。研究显示：LPA能够上调卵巢癌细胞uPA的分泌而不影响uPAR的表达，抑制uPA蛋白表达可以明显降低LPA诱导的卵巢癌细胞的侵袭，因此针对LPA及其与uPA关系的研究将有助于我们更好的了解LPA在卵巢癌侵袭、转移中的作用。 RNA干扰技术作为生物学领域的一种全新的技术，越来越受到广大研究者的重视并在肿瘤基因治疗中有着巨大的发展潜力。选择对肿瘤有治疗作用的靶基因是利用RNA干扰技术进行基因治疗的关键所在。在LPA诱导的肿瘤细胞侵袭转移的研究中发现，尽管其他受体也起作用，但LPA受体2(LPA2)在LPA诱导的侵袭相关因子的分泌中起关键作用。故本研究选择LPA2作为RNA干扰基因治疗的靶点。 基于以上报道，本研究首先观察LPA对人卵巢癌SKOV-3细胞uPA蛋白分泌和细胞侵袭能力的影响；其次，通过脂质体介导法将针对LPA2的小干扰RNA转染人卵巢癌SKOV-3细胞，观察转染后卵巢癌SKOV-3细胞中LPA2 mRNA和蛋白的表达情况；同时研究LPA2受体抑制后对LPA诱导的uPA蛋白分泌、细胞侵袭和迁移能力的影响，探讨LPA2受体在LPA诱导的卵巢癌侵袭转移中的作用。 第一部分溶血磷脂酸对卵巢癌SKOV-3细胞uPA分泌的影响 目的：研究发现，在卵巢癌患者的血浆和腹水中LPA的水平明显升高，且其水平与卵巢癌的生物学行为有一定的相关性。本研究旨在探讨溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)对人卵巢癌SKOV-3细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)分泌和细胞侵袭能力的影响。 方法： 1.常规培养的人卵巢癌SKOV-3细胞，加入不同浓度的LPA(0、2、20、40、80μmol/L)作用24小时后，收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测溶血磷脂酸作用后，人卵巢癌SKOV-3细胞上清液中uPA蛋白的表达。 2.常规培养的人卵巢癌SKOV-3细胞，加入80μmol/L LPA，作用0、3、8、12、24小时后，收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测溶血磷脂酸作用后，人卵巢癌SKOV-3细胞上清液中uPA蛋白的表达。 3.常规培养的人卵巢癌SKOV-3细胞，加入0或80μmol/L LPA后，利用Matrigel Transwell小室法检测LPA对SKOV-3细胞体外侵袭能力的影响。 结果： 1.加入不同浓度的LPA，作用24小时后，2μmol/L LPA即可引起uPA分泌增加，但与对照相比无明显的统计学差异(P＞0.05)；而加入20、40、80μmol/L LPA后，uPA蛋白分泌量明显增加(P＜0.001)。 2.加入80μmol/L LPA，作用不同时间后，与对照相比，8小时后LPA诱导的uPA产量即明显增加(P＜0.01)。 3.Matrigel Transwell小室检测80gmol/L LPA作用后，穿透人工基底膜的SKOV-3细胞数较无LPA作用的对照组明显增多(219.4±23.6 vs.67±10.9)(P＜0.001)。 结论： 1.低浓度的LPA即可诱导uPA分泌增加，且随着LPA浓度的加大，uPA产量明显增多,二者间呈现明显的浓度依赖性。 2.相同浓度LPA作用于SKOV-3细胞，随着时间的延长uPA分泌量增多，二者间呈现明显的时间依赖性。 3.LPA可以明显增加SKOV-3细胞的体外侵袭能力。 目的：运用RNA干扰技术抑制卵巢癌SKOV-3细胞中LPA2基因的表达，观察LPA2基因沉默对LPA诱导的uPA产量和细胞侵袭、迁移能力的影响，探讨RNA干扰技术在抗肿瘤基因治疗方面的应用前景以及沉默LPA2基因作为卵巢肿瘤治疗靶点的可能性。 方法： 1.复苏、培养卵巢癌细胞株SKOV-3至对数生长期，将实验分成三组，即正常对照组、阴性对照组和干扰组。 2.经脂质体介导将不同浓度梯度的siRNA转染至SKOV-3细胞中，观察转染效果，筛选出最佳转染浓度。 3.将特异性siRNA及阴性对照siRNA分别转染至干扰组和阴性对照组，正常对照组未作任何siRNA的转染，仅加转染液。 4.转染36小时后采用半定量RT-PCR和Western blot检测LPA2 mRNA和蛋白的表达情况。 5.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测干扰前、后LPA诱导的uPA产量的变化，采用Matrigel Transwell小室法和Transwell Chemotaxis实验检测干扰后LPA对卵巢癌细胞体外侵袭和迁移能力的影响。 结果： 1.半定量RT-PCR和Western blot结果显示siRNA转染后，SKOV-3细胞LPA2 mRNA表达受抑制、蛋白表达水平降低。 2.ELISA结果显示干扰后80μmol/L LPA诱导的uPA产量下降，干扰组uPA蛋白表达(OD值：0.344±0.039)较阴性对照组uPA蛋白表达(OD值：0.746±0.031)明显降低(P＜0.001)。 3.Matrigel Transwell小室实验结果显示，80μmol/L LPA刺激后，干扰组穿过Matrigel膜的细胞数(36.2±3.3)，明显低于阴性对照组(178±17.2)(P＜0.001)。 4.Transwell Chemotaxis实验结果显示，80μmol/L LPA刺激后，干扰组进入下室的细胞数(57±7.6)较阴性对照组(220.4±25.5)明显下降(P＜0.001)。 结论： 1.针对LPA2基因的特异性siRNA成功转染SKOV-3细胞后，能够特异性抑制、降解同源mRNA，有效阻滞LPA2 mRNA和蛋白的表达，可作为特异性阻断LPA2基因表达、评价其功能的良好手段。 2.经RNA干扰技术特异性沉默LPA2基因后，能够明显抑制LPA诱导的SKOV-3细胞uPA的分泌及细胞的侵袭和迁移能力，提示LPA2可能成为卵巢癌治疗的靶基因。