研究背景冠状动脉旁路移植术（Coronary artery bypass grafting,CABG）是缺血心肌血运重建的重要手段,是目前治疗冠心病的常用和有效方法。大隐静脉是CABG最常用的血管移植材料之一,其临床使用率超过70%,然而长期的随访结果显示CABG术后1年近15%-25%的桥静脉血管出现狭窄,术后10年再狭窄率超过50%。移植静脉再狭窄是心血管外科领域尚未解决的重要临床问题,且目前尚无有效的防治措施,而基因治疗用于防治移植静脉术后再狭窄具有很好的可行性和安全性,具有广阔的应用前景。研究表明血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）表型转化、过度增殖、迁移到内膜及产生的细胞外基质堆积是移植静脉术后再狭窄发生的主要病理机制。近年来的研究发现,microRNA参与了心血管病领域很多重要的生理和病理过程,也是调控VSMC生物学功能的重要因子。miR-17~92簇是调控细胞增殖和分化的重要microRNA之一,在多种肿瘤研究中,miR-17~92簇是肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡的重要调控因子。此外,miR-221也是调控VSMC的促增殖、促迁移和抗凋亡的关键因子,通过调控靶基因p27（Kip1）和p57（Kip2）的下调从而促进VSMC的增殖和表型转换。研究目的本课题拟通过构建移植静脉术后再狭窄动物模型和VSMC增殖细胞模型明确miR-17~92簇是否参与VSMC表型转化和增殖迁移的调控,及其在移植静脉术后内膜增生形成中的作用机制。为了充分验证miRNA Sponge技术在移植静脉再狭窄基因治疗中的有效性和安全性,通过构建miR-221-Sponge进一步明确是否可以有效抑制移植静脉术后再狭窄的发生。研究方法构建大鼠移植静脉再狭窄模型,应用microRNA芯片筛选出与移植静脉再狭窄发生密切相关的miRNAs,并通过qRT-PCR验证。构建静止型和去分化型VSMC模型,检测细胞表型转化及miR-17~92前体表达情况。构建miRNA-17~92过表达和沉默腺病毒表达载体,应用qRT-PCR、Western-blot和免疫荧光技术检测VSMC细胞表型转化,细胞计数和Brdu法检测细胞增殖,划痕和Transwell实验检测细胞迁移能力。应用数据库分析和细胞实验初步验证miR-17~92簇调控的可能潜在靶基因。应用miRNA Sponge技术敲除移植静脉中miR-17~92和miR-221的表达,通过Poloxamer-407-胰蛋白酶混合凝胶经血管外膜途径局部转染移植静脉,术后通过彩超评估移植静脉吻合口血流动力学情况,进行HE染色测定移植静脉内膜增生情况,免疫组织化测定桥静脉中VSMC增生情况,免疫荧光染色分析移植静脉中VSMC表型转化情况。研究结果应用microRNA芯片技术和qRT-PCR检测验证发现,miRNA-17~92簇的6个成员（miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-20a,miR-19b,and miR-92a）在移植静脉组织中相对正常静脉组织均表达上调。miR-17~92前体在VSMC增殖模型中表达水平增高,并对PDGF的刺激具有时间和浓度依赖性。通过miRNA Sponge抑制技术沉默miR-17~92的表达可显著抑制VSMC的增殖和迁移能力,同时增加VSMC收缩型特异性蛋白如SMA、Calponin和SM-MHC的表达。经初步分析验证,PTEN可能是miR-17~92簇介导转录后调控的重要潜在靶基因之一。动物实验结果显示,通过腺病毒介导的miR-17~92簇Sponge和miR-221 Sponge局部基因治疗,可有效抑制移植静脉术后内膜增生和VSMC增殖和表型转换,有效改善移植静脉术后吻合口血流动力学指标,且并未增加移植静脉术后炎症反应的程度。结论miR-17~92簇是参与VSMC增殖、迁移和表型转换的重要的调控因子,在转录后水平通过调控靶基因PTEN促进VSMC增殖和迁移。应用miRNA Sponge技术靶向沉默miR-17~92簇和miR-221防治移植静脉术后再狭窄具有相当的有效性和安全性。该研究为CABG术后移植静脉再狭窄的防治研究提供了新的理论依据和研究切入点。