本研究分为二部分： 第一部分 骨肉瘤患者的血清蛋白质组学研究 近二十年来实施的手术联合大剂量化疗，使骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)手术后五年生存率提高到60-70﹪，但许多患者在确诊时或病程中已发生肺转移，给治疗带来很大困难。长期的诊断与治疗研究显示，找到骨肉瘤特异性生物标记物是早期诊断和提高疗效的新途径。蛋白质组学在寻找生物标记物方面具有高通量，高效率。2-D DIGE是近年来发展的新蛋白质组技术，通过内标的建立，大大减少了人为因素影响，可信度大幅提高。骨肉瘤患者血清2-D DIGE技术尚未建立，应用该技术寻找骨肉瘤患者血清中表达差异蛋白质的研究，目前国内外均未见报道。对OS患者血清进行蛋白组学研究，寻找患者血清中差异表达的蛋白质，并与以往对OS的基因研究资料相结合，不仅有助于从分子水平认识OS的发生发展机制，也可以为OS的筛选和诊断提供有效的分子标记物，并有望为OS的防治提供新的分子靶点。 目的: 1．建立骨肉瘤患者血清双向胶内差异凝胶电泳技术体系，为利用该技术研究骨肉瘤患者血清蛋白组变化奠定基础。 2．建立OS的蛋白质指纹(PMF)。 3．寻找骨肉瘤患者血清中表达差异的蛋白质，探讨这些蛋白在骨肉瘤发生发展中的作用，为骨肉瘤的早期诊断和筛选提供潜在的分子标记物。 4．应用Western blot和ELISA方法，验证质谱鉴定结果的真实性、可靠性。 方法: 1．收集骨肉瘤患者和正常成人血清样本各4例，血清经PROT-BA Kit试剂盒处理后，分别进行不同的CyDye染料交叉标记，然后依次进行双向胶内差异凝胶电泳、图像扫描，并用专用分析软件DeCyderv6.0，比较各组样本间蛋白点图像差异，并评估该技术体系。 2．提取32例骨肉瘤患者及30例正常成人血清蛋白，用不同的CyDye染料交叉标记后，依次进行双向胶内差异凝胶电泳以分离蛋白质、图像分析以寻找表达差异的蛋白点，对表达差异的蛋白点进行基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱分析，获得肽指纹图谱，检索MASCOT、数据库鉴定蛋白。 3．用Western Blot和ELISA方法，对明显的差异蛋白验证。 结论： 1．成功建立了骨肉瘤患者血清双向胶内差异凝胶电泳技术体系，为研究骨肉瘤发生发展分子机制提供了一种有效手段。 2．2-D DIGE分析结果进行质谱鉴定，PMF法成功鉴定出43个蛋白质，从中筛选出属于差异性蛋白质43种。质谱鉴定出43个骨肉瘤相关血清蛋白质，18个蛋白质点上调，25个蛋白质点下调，为进一步研究奠定了基础。 3．比较骨肉瘤和正常人血清蛋白质2-D DIGE图谱，初步确定了2个骨肉瘤上调血清蛋白点(SAA、CP)和1个骨肉瘤下调蛋白点(Gelsolin)与骨肉瘤发病和发展密切相关。SAA的血清含量在骨肉瘤患者化疗前、后、术后以及复发等同治疗阶段均有变化。 第二部分 Grifolin/Oridonin诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子机制 化疗是治疗骨肉瘤的三大手段之一，但目前传统的化疗药物主要是细胞毒药物，不可避免地会影响正常细胞，带来临床上常见的各种不良反应。另一方面耐药性的产生也限制了这类药物在临床上的应用。从天然物质(尤其是中药)中寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物成为近年的研究热点。针对促凋亡作用和特定靶点的药物研究是肿瘤化疗药物开发的主要方向之一。近几年来，天然中草药的抗癌作用靶点的研究成为近年来国内外药物研发的热门。寻找靶点的抗肿瘤药物研究具有广阔的前景，但国外已开发的靶点(如Akt)特异性抗肿瘤候选化合物大多稳定性差，细胞通透性和溶解度不佳，目前仍处于临床前期的研究。而本课题组在用体外生化检测法筛选天然产物及其衍生物时发现，Grifolin(奇果菌素)和Oridonin(冬凌草甲素)在体外能明显抑制Akt激酶的活性。Grifolin是从奇果菌分离出的多糖，具有显著的抗炎、抗肿瘤、杀菌、抗病毒和免疫调节等作用。Oridonin是冬凌草的主要有效成分，是从冬凌草中提取出来的一种以贝壳杉烯(ent-kaurene)为骨架的四环二萜类化合物，大量资料证明它对多种肿瘤均具有明显的抑制作用，其对实体瘤如食道癌、肝癌等的治疗已广泛应用于临床，并取得了明显的疗效。 目的: 本研究分别探讨Grifolin和Oridonin对两种骨肉瘤细胞(U20S和MG63细胞)凋亡及其作用机制，以及对Akt活性抑制作用，骨肉瘤细胞内对Akt磷酸化的影响和Akt下游靶分子的影响研究，为这些药物的研究、开发和临床应用提供理论和实验依据。 方法: 1．MTT法测定Grifolin和Oridonin对细胞存活率的影响。 2．Hoechst33258染色和流式细胞术，分别检测Grifolin和Oridonin处理后细胞形态学改变和DNA含量的变化，线粒体膜电位变化，对细胞色素C的释放影响。 3．采用Western Blot检测，分析相关蛋白质磷酸化水平变化。 4．统计学分析所有数据用6次独立实验的平均值表示，结果进行t检验、方差分析，用SPSS 14.0 for Windows统计软件进行数据分析。 结论： 1、Grifolin和Oridonin均能抑制骨肉瘤细胞U2OS和MG63增殖，并诱导肿瘤细胞发生凋亡。 2、通过实验证明，Grifolin和Oridonin能在体外抑制Akt的活性。Grifolin和Oridonin在细胞内通过抑制Akt的活性及其下游信号途径诱导肿瘤细胞凋亡。 3、Oridonin有可能影响MAPKs通路来诱导肿瘤细胞凋亡。 4、Grifolin和Oridonin诱导的U2OS和MG63细胞凋亡机制既有相似之处，又有各自信号转导的特点。