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研究背景：
随着当今社会人们生活环境和生活方式的变化，各种癌症的发病率呈现不断上升的趋势。而目前在全球范围内，肺癌的发病率和死亡率都位居所有癌症相关疾病的首位。据统计，全球每年新增肺癌病例约200万人，其中死于肺癌的病例高达176万人，死亡率达88%。研究表明，吸烟、大气污染、职业和环境接触、电离辐射和遗传等因素是影响肺癌发生发展的主要诱因。尽管目前人们利用外科手术、化疗和分子靶向治疗等技术手段使肺癌患者的生存率有了很大改善和提高，但由于肺癌长期预后差，诊断后5年生存率仅在15%左右。人们需要更加深入探究肺癌在发生发展过程中潜在的细胞分子生物学机制以提高对肺癌的综合防治效果。
自噬作为一种高度保守的细胞代谢过程，是由溶酶体介导的可将细胞内受损细胞器和有害蛋白物降解成各种小分子，进入胞质循环再利用的细胞程序性调节方式。一方面，当细胞的内环境稳态被打破而有恶性转化的倾向时，自噬可清理受损细胞器、毒性代谢产物等，保持DNA的稳定性，从而促进细胞存活，抑制肿瘤的发生；另一方面，当细胞出现失控以及长时间的自噬调节，会形成过度的自我消化和导致细胞内重要物质的降解，最终使细胞进入死亡。但自噬在调控细胞存活和细胞死亡的分子生物学机制尚未完全明确。大量研究表明，肿瘤细胞中广泛存在自噬水平的异常，细胞自噬与肿瘤的发生发展过程有密切的关系。而在肿瘤发育的不同阶段，自噬相关基因发挥着不同的调节作用。
研究发现，自噬作为细胞对体内物质进行再循环利用的一种代谢方式，对肿瘤细胞的影响表现为双重作用，既可抑制肿瘤细胞生长发育，也能一定程度上促进肿瘤细胞的增殖。大量研究表明，在肿瘤形成早期，细胞可通过自噬维持基因的完整性、控制基因的转录和蛋白质的翻译水平、清除活性自由基等其他压力因素，从而对肿瘤细胞的形成发展起到一定的抑制作用。而当肿瘤内部发育至肿瘤细胞缺乏营养物质时，肿瘤细胞可通过降解蛋白质和细胞器，为自身提供氨基酸、核苷酸和能量物质等大分子物质，避免其走向死亡。由此可见，自噬在肿瘤的不同发展阶段发挥着不同的作用。
目前，针对肺癌研究的细胞分子生物学研究如火如荼，阐明细胞自噬在肺癌发生发展过程中的生理机制可为未来探索肺癌治疗新策略提供思路。本研究以结晶型硫化镍(NiS)和反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE)恶性转化及接种裸鼠成瘤的人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2为实验对象，主要利用实时荧光检测，结合WesternBlot、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及荧光染色等生物学技术研究人支气管上皮细胞16HBE恶性转化后自噬途径的启动机制，从而进一步探讨自噬作用与肺癌细胞之间的关系。
方法：
1.体外培养正常人支气管上皮细胞16HBE及其两种恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2，用CCK-8法检测EaglesBalancedSaltSolution(EBS)饥饿处理后的细胞存活率。
2.用Hoechst33258实验进一步比较正常细胞和恶性转化细胞在饥饿条件下的凋亡情况。
3.利用Lipofectamine3000转染GFP-LC3质粒到细胞中，通过荧光显微镜动态实时观测正常细胞和恶性转化细胞在饥饿条件下的自噬水平变化情况。
4．利用WesternBlot检测正常细胞和恶性转化细胞在饥饿处理早期自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平。
5.利用qRT-PCR方法检测正常细胞和恶性转化细胞在饥饿处理12h后的BECN1和LC3基因的mRNA表达量。
结果：
1.经过EBS饥饿处理后，无论是正常细胞还是恶性转化细胞，它们的存活率在6小时后都开始明显下降（p＜0.01），但恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2比正常细胞下降的速度要慢很多，且随着处理时间的延长，恶性转化细胞的存活率一直大于正常细胞。
2.Hoechst33258实验表明，饥饿处理24h后，正常细胞16HBE的细胞核中出现很多浓染致密的颗粒状荧光，而恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的细胞核染色仍旧呈现均匀弥散状态。
3.在对正常细胞16HBE和其恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2进行GFP-LC3质粒的实时动态观察中发现：在未处理的情况下，正常细胞的GFP-LC3蛋白聚点明显多于恶性转化细胞，而经过EBS饥饿诱导处理6h后，恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的GFP-LC3蛋白荧光聚点变化不大，而正常细胞的聚点开始明显减少，一直到处理24h后，正常细胞的聚点几乎全部消失，而恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的GFP-LC3蛋白荧光聚点开始出现，且这些聚点一直到36h后仍没有消失。
4.通过WesternBlot实验发现，正常细胞的自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平在饥饿处理6h后都呈现明显的上升趋势，而两种恶性转化细胞则相反。
5.qRT-PCR实验表明，恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的自噬相关基因BECN1和LC3的mRNA表达水平在营养饥饿达24h的不利环境后期，较正常细胞明显上升（p＜0.01）。
结论：
1.结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化细胞在EBS饥饿处理后的抗凋亡能力比正常细胞16HBE强。
2.饥饿诱导处理后正常细胞16HBE会快速启动自噬途径引起细胞的凋亡，而恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2启动自噬的速度较慢，且后期维持一定的自噬水平，从而给细胞一定的时间来逃避凋亡。
3.恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2可能在饥饿处理6h之内通过减少Beclin1蛋白的表达水平来对抗凋亡。
4.恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2随着饥饿处理时间的增加有可能通过上调LC3基因的转录水平来启动自噬途径，从而让细胞能活得更久一些，但细胞同时也通过上调BECN1的转录水平开启了凋亡途径，两者博弈后最终使得恶性转化后的细胞在饥饿处理24h后慢慢走向死亡。
随着当今社会人们生活环境和生活方式的变化，各种癌症的发病率呈现不断上升的趋势。而目前在全球范围内，肺癌的发病率和死亡率都位居所有癌症相关疾病的首位。据统计，全球每年新增肺癌病例约200万人，其中死于肺癌的病例高达176万人，死亡率达88%。研究表明，吸烟、大气污染、职业和环境接触、电离辐射和遗传等因素是影响肺癌发生发展的主要诱因。尽管目前人们利用外科手术、化疗和分子靶向治疗等技术手段使肺癌患者的生存率有了很大改善和提高，但由于肺癌长期预后差，诊断后5年生存率仅在15%左右。人们需要更加深入探究肺癌在发生发展过程中潜在的细胞分子生物学机制以提高对肺癌的综合防治效果。
自噬作为一种高度保守的细胞代谢过程，是由溶酶体介导的可将细胞内受损细胞器和有害蛋白物降解成各种小分子，进入胞质循环再利用的细胞程序性调节方式。一方面，当细胞的内环境稳态被打破而有恶性转化的倾向时，自噬可清理受损细胞器、毒性代谢产物等，保持DNA的稳定性，从而促进细胞存活，抑制肿瘤的发生；另一方面，当细胞出现失控以及长时间的自噬调节，会形成过度的自我消化和导致细胞内重要物质的降解，最终使细胞进入死亡。但自噬在调控细胞存活和细胞死亡的分子生物学机制尚未完全明确。大量研究表明，肿瘤细胞中广泛存在自噬水平的异常，细胞自噬与肿瘤的发生发展过程有密切的关系。而在肿瘤发育的不同阶段，自噬相关基因发挥着不同的调节作用。
研究发现，自噬作为细胞对体内物质进行再循环利用的一种代谢方式，对肿瘤细胞的影响表现为双重作用，既可抑制肿瘤细胞生长发育，也能一定程度上促进肿瘤细胞的增殖。大量研究表明，在肿瘤形成早期，细胞可通过自噬维持基因的完整性、控制基因的转录和蛋白质的翻译水平、清除活性自由基等其他压力因素，从而对肿瘤细胞的形成发展起到一定的抑制作用。而当肿瘤内部发育至肿瘤细胞缺乏营养物质时，肿瘤细胞可通过降解蛋白质和细胞器，为自身提供氨基酸、核苷酸和能量物质等大分子物质，避免其走向死亡。由此可见，自噬在肿瘤的不同发展阶段发挥着不同的作用。
目前，针对肺癌研究的细胞分子生物学研究如火如荼，阐明细胞自噬在肺癌发生发展过程中的生理机制可为未来探索肺癌治疗新策略提供思路。本研究以结晶型硫化镍(NiS)和反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE)恶性转化及接种裸鼠成瘤的人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2为实验对象，主要利用实时荧光检测，结合WesternBlot、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及荧光染色等生物学技术研究人支气管上皮细胞16HBE恶性转化后自噬途径的启动机制，从而进一步探讨自噬作用与肺癌细胞之间的关系。
方法：
1.体外培养正常人支气管上皮细胞16HBE及其两种恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2，用CCK-8法检测EaglesBalancedSaltSolution(EBS)饥饿处理后的细胞存活率。
2.用Hoechst33258实验进一步比较正常细胞和恶性转化细胞在饥饿条件下的凋亡情况。
3.利用Lipofectamine3000转染GFP-LC3质粒到细胞中，通过荧光显微镜动态实时观测正常细胞和恶性转化细胞在饥饿条件下的自噬水平变化情况。
4．利用WesternBlot检测正常细胞和恶性转化细胞在饥饿处理早期自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平。
5.利用qRT-PCR方法检测正常细胞和恶性转化细胞在饥饿处理12h后的BECN1和LC3基因的mRNA表达量。
结果：
1.经过EBS饥饿处理后，无论是正常细胞还是恶性转化细胞，它们的存活率在6小时后都开始明显下降（p＜0.01），但恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2比正常细胞下降的速度要慢很多，且随着处理时间的延长，恶性转化细胞的存活率一直大于正常细胞。
2.Hoechst33258实验表明，饥饿处理24h后，正常细胞16HBE的细胞核中出现很多浓染致密的颗粒状荧光，而恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的细胞核染色仍旧呈现均匀弥散状态。
3.在对正常细胞16HBE和其恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2进行GFP-LC3质粒的实时动态观察中发现：在未处理的情况下，正常细胞的GFP-LC3蛋白聚点明显多于恶性转化细胞，而经过EBS饥饿诱导处理6h后，恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的GFP-LC3蛋白荧光聚点变化不大，而正常细胞的聚点开始明显减少，一直到处理24h后，正常细胞的聚点几乎全部消失，而恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的GFP-LC3蛋白荧光聚点开始出现，且这些聚点一直到36h后仍没有消失。
4.通过WesternBlot实验发现，正常细胞的自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平在饥饿处理6h后都呈现明显的上升趋势，而两种恶性转化细胞则相反。
5.qRT-PCR实验表明，恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2的自噬相关基因BECN1和LC3的mRNA表达水平在营养饥饿达24h的不利环境后期，较正常细胞明显上升（p＜0.01）。
结论：
1.结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化细胞在EBS饥饿处理后的抗凋亡能力比正常细胞16HBE强。
2.饥饿诱导处理后正常细胞16HBE会快速启动自噬途径引起细胞的凋亡，而恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2启动自噬的速度较慢，且后期维持一定的自噬水平，从而给细胞一定的时间来逃避凋亡。
3.恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2可能在饥饿处理6h之内通过减少Beclin1蛋白的表达水平来对抗凋亡。
4.恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2随着饥饿处理时间的增加有可能通过上调LC3基因的转录水平来启动自噬途径，从而让细胞能活得更久一些，但细胞同时也通过上调BECN1的转录水平开启了凋亡途径，两者博弈后最终使得恶性转化后的细胞在饥饿处理24h后慢慢走向死亡。