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目的:在已有的研究基础上,研究珠母贝糖胺聚糖(GAG)抗L<,1210>白血病作用,探讨其在抑制肿瘤血管生成、增强机体免疫力方面的抗肿瘤作用机理。
方法:1.双酶法提取珠母贝GAG粗品(CPG),DEAE-52-纤维素柱分离纯化珠母贝GAG,采用小鼠急性毒性实验检测CPG的毒性。
2.采用体内外实验法探讨珠母贝GAG的抗L<,1210>白血病作用。MTT法检测珠母贝GAG粗品(CPG)、纯化级分(GAG-1、GAG-2)体外对L<,1210>细胞生长的抑制作用,并探讨CPG与化疗药顺铂(DDP)合用时对L<,1210>细胞生长的抑制效果。建立移植性L<,1210>白血病荷瘤小鼠模型,检测CPG对荷L<,1210>白血病小鼠的生命延长率及腹围的影响,并初步探讨CPG和环磷酰胺(CY)的协同抑瘤作用。
3.以鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)为模型,检测CPG、GAG-1、GAG-2对CAM血管生成的影响,并探讨CPG、GAG-1、GAG-2与5-氟尿嘧啶(5-FU)合用时对CAM血管生成的抑制效果,以探讨珠母贝GAG抗肿瘤血管生成方面的抗肿瘤作用机理。
4.检测CPG对正常及免疫抑制小鼠脾指数、胸腺指数的影响,CPG、GAG-1、GAG-2体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红及产生一氧化氮(NO)能力的影响,CPG、GAG-l、GAG-2体外对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响,探讨珠母贝GAG增强机体免疫力方面的抗肿瘤作用机理。
结果:1.本实验提取纯化的珠母贝糖胺聚糖各级分(CPG、GAG-1、GAG-2)主要技术指标与本实验室前期研究结果基本一致,说明珠母贝GAG提取纯化技术成熟,结果稳定。急性毒性实验结果显示,CPG对小鼠经口的半数致死量LD<,50>>21.50g/kg,为安全无毒。
2.CPG、GAG-1、GAG-2体外对L<,12l0>细胞生长均有一定的抑制作用,其中GAG-1效果最好,在250ug/ml剂量下作用24h,抑制率达51.7%(P<0.01)。CPG和GAG-2抑制效果相当,相同条件下,CPG、GAG-2的抑制率分别为31.4%(P<0.01)、23.8%(P<0.05)。CPG与DDP合用能增强DDP对L<,1210>细胞生长的抑制效果,100ug/ml剂量的CPG与0.1ug/ml剂量的DDP共同作用24h能使DDP的抑制率从11.0%(P<0.05)升高到42.4%(P<0.01)。CPG具有一定的延长荷L<,1210>白血病小鼠生命的作用,其中100mg/kg剂量组小鼠的生命延长率为19.3%(P<0.05)。腹围测定结果显示,CPG不同剂量组的小鼠腹围均少于生理盐水对照组,但无统计学意义,其结果与生命延长率有一定的相关性。另外实验结果还显示:30mg/kg剂量的CPG与环磷酰胺(CY)合用并不能增强CY对L<,1210>白血病小鼠的生命延长作用。
3.CPG、GAG-l、GAG-2在实验所选剂量(0.5ug/ml、5ug/ml、50ug/ml、500ug/ml)下,无明显的直接抑制CAM血管生成作用,但CPG、GAG-1、GAG-2在实验所选
剂量(5ug/ml、50ug/m1)下跟5-FU(2.5ug/m1)合用时,均能显著增敏5-FU的抑制CAM血管生成作用(P<0.01),并呈一定的剂量效应关系,其中GAG-1、GAG-2增敏效果更显著。
4.CPG完全能对抗环磷酰胺(CY)引起的胸腺萎缩,对正常小鼠的胸腺亦有明显的增重作用;CPG还能抗CY引起的脾萎缩,对正常小鼠的脾则无明显影响。CPG、GAG-1在体外均能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和产生NO的能力(P<0.01或P<0.05),且具有剂量效应关系,相同剂量下,CPG对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和产生NO的能力效果好于GAG-1。GAG-2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和产生NO的能力无明显影响。CPG、GAG-1、GAG-2在体外均能直接促进小鼠脾淋巴细胞增殖(p<0.01),并能协同ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖(p<0.01)。
结论:珠母贝GAG有一定的抗L<,12l0>白血病作用。珠母贝GAG能显著增敏5-FU抑制CAM血管生成作用,其在体内增敏化疗药5-FU抗肿瘤作用机理之一可能是促进了5-FU抑制肿瘤血管的生成。珠母贝GAG具有增强免疫功能,其在体内抗肿瘤作用机理之一是增强了机体免疫力。