论文部分内容阅读
角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2) 是成纤维细胞生长因子家族的一员，能够特异性促进上皮细胞的生长、增殖和分化。在个体发育过程中，KGF-2调控多种组织和器官的形成；动物模型研究表明，KGF-2在促进皮肤创口愈合，预防放疗引起的粘膜炎，以及治疗溃疡和肠炎等方面都有显著疗效；另外，KGF-2的过量表达还与某些组织和器官的肿瘤发生密切相关。KGF-2的诸多生物学功能主要是通过激活其细胞膜表面受体FGFR2IIIb介导的信号通路完成的，因此，通过对KGF-2与FGFR2IIIb相互作用分子机制的研究，确定KGF-2的关键受体结合和活性位点，将对控制KGF-2信号以及合理设计用于人类疾病治疗的KGF-2药物及其拮抗剂具有重要意义。此外，KGF-2具有核转位现象，但目前对其核转位的机制和功能还不清楚，也未见研究和报道。本实验利用计算机分子模拟系统对KGF-2与FGFR2IIIb结合的关键位点进行了分析，同时综合同源序列的比较结果，设计并构建了五个KGF-2突变体：AGBH、T114A、T114R、G160H和LY。首先，利用PCR方法克隆了人KGF-2成熟肽的cDNA序列，并以此cDNA为模板，利用重叠延伸PCR方法构建了各突变体的编码DNA序列。然后，将它们分别插入pET-17b载体中，利用E.coli BL21进行了表达，结果表明重组KGF-2及其各突变体的表达量在13％-30％之间，主要以可溶性形式表达。利用阳离子交换柱对它们进行纯化，纯度可达90％以上。分别利用竞争性ELISA和MTT法进行的受体亲合力和对RTE细胞生长作用的检测结果表明，标准品、重组KGF-2及其突变体均能够促进RTE细胞的增殖，并且作用效果表现出明显的剂量依赖特性；重组KGF-2与标准品的受体亲合力和促增殖作用基本一致；与重组KGF-2相比，LY的受体亲合力和促增殖活性都显著增加，AGBH的受体亲合力稍有增加，但促增殖活性显著增加，T114A的受体亲合力基本不变，但促细胞增埴活性显著下降，T114R和G160H的受体亲合力和促细胞增殖活性都显著下降。上述结果表明，Thr114、 A、B、Gly160和L都是KGF-2重要的FGFR2IIIb结合位点及活性位点，它们的改变对KGF-2的受体亲合力和活性影响很大。同时，AGBH和T114A在受体 中文摘要亲合力没有很大改变的情况下，促细胞增殖活性却发生了极大变化，表明rhrl 14、A和B对KGF一2激活受体至关重要。利用SG工Ori 9 1 n 300图形工作站和B工OSYM/MSI分子模拟系统，模建了各突变体的结构。对突变前后各突变位点氨基酸残基与受体相互作用的分析结果表明，受体亲和力的改变是所有发生变化的作用力相互抵消和均衡的结果，并不取决于某单一作用力的改变。 利用酵母双杂交系统筛选到两个与KGF一2有相互作用的蛋白质，分别是P即2605和RPL22，但进一步利用哺乳动物双杂交系统只检测到即L22与K(;F一2在COS7细胞中的相互作用。RPL22的N末端具有经典的核定位信号，其很可能参与了K(不一2的核转位过程。KGF一2相互作用蛋白RPL22的发现，为进一步探讨KGF一2核转位的具体过程及功能提供了重要线索。