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目的： 沙门菌质粒毒力基因spvB编码产物具有ADP核糖基转移酶作用，与细菌毒力关系密切，目前该基因的功能还有很多未知。本研究第一部分通过对沙门菌质粒毒力基因spvB进行生物信息学分析、克隆表达并制备相应抗体，为后续深入研究该基因的功能提供工具和手段。第二部分通过建立沙门菌感染的巨噬细胞模型，研究spvB对NF-κB信号通路相关蛋白IκBα和p65等表达的影响；利用与真核表达载体连接的重组质粒pEGFP-N1-SpvB瞬时转染HeLa细胞，进一步分析spvB对NF-κB通路的影响，探讨该基因对宿主菌毒力影响的分子机制。 方法： 一.沙门菌质粒毒力基因spvB的原核表达及其抗体的制备 1.通过生物信息学软件分析spvB基因及其编码的蛋白，选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列。 2.根据spvB基因序列设计引物，以携带spvB基因的野生型鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. typhimurium，STM）为模板，PCR扩增获得目的片段后与原核表达载体pET-28a连接，将质粒pET28a-SpvB转化至大肠埃希菌BL21（DE3）后，IPTG诱导表达并纯化。用SpvB蛋白免疫健康小鼠，制备抗SpvB多克隆抗体，Western blot检测抗体特异性。 二．沙门菌质粒毒力基因spvB对NF-κB信号通路的影响 1.以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌野生株 STM-WT、消除spvB基因的突变株STM-ΔspvB及回补株STM-c-ΔspvB分别与小鼠腹腔巨噬细胞J774A.1共培养，建立细胞感染模型。Western blot检测NF-κB通路相关蛋白IκBα和p65等的表达；荧光显微镜下观察p65的核转运；Western blot检测Caspase-3的活化；比色法测定Caspase-3的活性；免疫共沉淀法检测IκBα的泛素化水平。 2.利用pRL-TK（内参质粒）、pNFκB-luc（报告基因质粒）、pEGFP-N1及pEGFP-N1-SpvB瞬时转染HeLa细胞，加入TNF-α刺激后，通过双荧光素酶报告基因检测系统检测spvB对NF-κB通路的影响；利用pEGFP-SpvB真核表达载体瞬时转染HeLa细胞，TNF-α刺激后，Western blot检测spvB基因对IκBα、p65等蛋白表达的影响。 结果： 一.沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备 1.成功构建pET28a-SpvB原核表达重组质粒，经IPTG诱导结果显示，重组蛋白表达且主要存在于包涵体中。 2.将纯化的SpvB蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，经Western blot验证该抗体能特异结合SpvB蛋白。 二．沙门菌质粒毒力基因spvB对NF-κB通路的影响 1. Western blot检测NF-κB通路相关蛋白IκBα和p65的表达，结果显示细菌与细胞共培养30 min后，STM-ΔspvB感染组细胞IκBα的表达量显著低于STM-WT感染组（P<0.01），与STM-c-ΔspvB感染组相比两组间无显著性差异（P>0.05）；感染4 h后，STM-ΔspvB感染组IκBα的表达量显著低于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P<0.01）；感染4 h和8 h后，STM-ΔspvB感染组Phospho-p65的表达水平高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P<0.05）。 2.荧光显微镜下观察p65的核转运，结果显示感染8 h后，STM-ΔspvB感染组细胞核中p65的表达显著高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组。 3. Western blot检测Caspase-3的激活，结果显示感染4 h和8 h后，STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组细胞Caspase-3出现明显的活化；比色法测定Caspase-3的活性，结果显示感染4 h和8 h后，STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组细胞Caspase-3活性高于STM-ΔspvB感染组（p<0.01）。 4.免疫共沉淀检测IκBα的泛素化水平，结果显示用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞24 h，细菌与细胞共培养4 h后，STM-ΔspvB感染组IκBα的泛素化水平高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组，而未经MG132处理各组间IκBα的泛素化差异不明显。 5.双荧光素酶报告基因检测系统检测spvB对NF-κB通路的影响，结果显示pEGFP-N1或 pEGFP-N1-SpvB瞬时转染 HeLa细胞24 h，TNF-α处理后，pEGFP-N1-SpvB转染组NF-κB的激活程度显著低于pEGFP-N1转染组（P<0.01）；pRL-TK、pNFκB-luc转染HeLa细胞24 h，三株受试菌感染细胞20 h后，STM-ΔspvB感染组NF-κB的激活程度显著高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P<0.01）。6. Western blot检测spvB基因对IκBα和p65等蛋白表达的影响，结果显示利用 pEGFP-N1-SpvB真核表达载体瞬时转染 HeLa细胞，TNF-α处理后，pEGFP-N1-SpvB质粒转染组Phospho-p65的表达显著低于pEGFP-N1转染组（P<0.01）而IκBα的表达显著高于pEGFP-N1转染组（P<0.01）。 结论： 1.成功构建SpvB原核表达载体，获得具有抗原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体，为后续深入研究该基因的功能奠定了基础。 2.利用沙门菌感染巨噬细胞和真核表达载体pEGFP-N1-SpvB转染的HeLa细胞模型，证实spvB抑制NF-κB通路的激活，为进一步探索spvB基因影响细菌毒力的分子机制提供理论和实验依据。