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弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界性分布的专性细胞内寄生原虫，属于顶复门生物，由法国学者Nicolle和Manceaux于1908年在北非刚地梳趾鼠的肝、脾单核细胞内发现的，因虫体呈弓形而得名。根据毒性和流行情况可将弓形虫分为三种类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。爱滋病病人感染的主要是Ⅱ型，Ⅰ型和Ⅱ型在先天性弓形虫病的病人已有报道，而从动物中分离的主要是Ⅲ型。人类感染弓形虫主要是通过进食含有包囊的未煮熟或生肉(主要是猪和羊)或者被猫粪中的卵囊污染的水或食物引起的。成人感染弓形虫后一般不表现为临床症状或者为自限性。孕妇感染后，弓形虫可通过胎盘传染胎儿导致早产、流产、死胎、畸胎等严重后果。免疫缺陷病人或者使用免疫抑制剂病人(如AIDS器官移植等)弓形虫慢性感染常可导致致死性的脑炎。羊感染弓形虫后也可导致流产和早产从而给畜牧业发展造成严重后果．美国第三次全国健康与营养调查研究表明，估计全国有23％的青少年和成人实验室证明感染了弓形虫。我国人群的感染率约在5％～20％，平均为8.5％。
P30蛋白是弓形虫速殖子表面主要抗原，在弓形虫入侵宿主细胞时起重要作用，是一种重要的疫苗侯选抗原。P30亚单位疫苗和核酸疫苗的研究多有报道，均表明可以产生一定的免疫保护性。但由于其表达具有期特异性，只能在速殖子阶段表达，所以不能产生针对各个阶段的特异性免疫保护。
ROP2是弓形虫棒状体分泌的一种蛋白，在入侵的宿主细胞的起始和整个过程与纳虫泡膜相连。其氨基端暴露于宿主细胞胞质侧，主要介导纳虫空泡与宿主细胞线粒体和内质网接触，在弓形虫的各个阶段均有表达。对弓形虫的存活、生长、复制起重要作用。
由于抗弓形虫病药物的毒副作用，及用药后仍可能发生再次感染，使得目前药物治疗弓形虫病非常困难。到目前为止，弓形虫病疫苗的研究取得一定的发展，活的减毒S48株被广泛应用于畜牧业的预防，但尚无可应用于人体的疫苗。由于弓形虫寄生生活的复杂性、形态的多变性，并且不同个体抗原递呈能力不一，仅利用某一时期、某一形态的单一抗原制备的单价疫苗往往不能提供对其他阶段弓形虫感染的保护性。
本研究将弓形虫主要表面抗原P30和棒状体蛋白ROP2候选抗原基因克隆到大肠杆菌/分枝杆菌穿梭表达载体pSTM3中，经电穿孔法转入耻垢分枝杆菌中构建重组M.S载体活疫苗，从而为弓形虫病的防治提供新的方法。
本研究的主要方法、结果及结论1．弓形虫速殖子表面抗原P30基因、棒状体抗原ROP2复合基因载体的构建、表达和鉴定方法：将液氮冻存的弓形虫速殖子复苏后，接种于小鼠腹腔，连续传代三次，收集小鼠腹水，分离纯化速殖子，常规方法提取基因组DNA。根据GenBank报道的p30基因和rop2基因序列的开放读码框架分别设计合成引物；PCR法扩增p30、rop2基因片段，重叠PCR法扩增P30-ROP2复合基因，经琼脂糖凝胶回收纯化后，克隆至TOPO-TA克隆载体；通过酶切、测序鉴定正确后，将P30-ROP2复合基因片段亚克隆至pET-30a(+)载体，构建成pET-30a-P30-ROP2质粒；转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达蛋白用SDS-PAGE初步分析，Western blot分析鉴定。
结果：提取弓形虫基因组DNA，PCR扩增出预期的p30片段(684bp)和rop2片段(1212bp)；成功构建了TOPO-P30-ROP2质粒，以及重组表达质粒pET-30a-p30-rop2；测序结果表明：与GenBank报道的基因序列相比，p30基因有1个碱基发生同义突变；ROP2基因有2个碱基不同，导致1个编码氨基酸发生改变，但都没有改变原序列的开放阅读框架。pET30-P30-ROP2转化大肠埃希菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达出了约75kDa的融合蛋白； Western blot分析鉴定证实该重组蛋白能被P30单克隆抗体识别。
结论：pET-30a-P30-ROP2重组表达质粒的成功构建、P30ROP2重组蛋白的高效表达，为下步实验打下了基础。
2．重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗的构建及鉴定方法：重新设计带有所需酶切位点的引物，以构建成功pET-30a-P30-ROP2质粒为模板，PCR法扩增P30-ROP2复合基因片段，经琼脂糖凝胶回收纯化后，克隆至TOPO-TA克隆载体；通过酶切、测序鉴定正确后，将P30-ROP2复合基因片段亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体psTM3，构建成pSTM3-P30-ROP2质粒；电穿孔法转化耻垢分枝杆菌MC<2>155，热诱导表达，表达蛋白用SDS-PAGE初步分析，Western blot分析鉴定；
总之，本研究成功提取了弓形虫RH株速殖子基因组DNA；构建了原核表达载体pET-30a-P30-ROP2和穿梭表达载体pSTM3-P30-ROP2，并诱导表达、鉴定了P30-ROP2重组融合蛋白，最终成功构建了弓形虫重组耻垢分枝杆菌疫苗。本研究为弓形虫病的防治提供了新的方法。