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研究目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明确的损伤肝因素外所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。其包括单纯性脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化、肝硬化甚至发展为肝癌。据统计,普通成人NAFLD发病率为10%~30%,其中10%~20%为NASH,后者10年内肝硬化发生率高达25%[1]。目前,NAFLD已被认为是替代病毒性肝炎成为未来数十年引起慢性肝病和肝脏移植的主要因素[2]。NAFLD的发病机制最新的理论―多重打击学说‖被广泛接受,主要指环境、个体基因以及肠道微生物等多种因素共同作用引起肝脏的脂肪变、炎症、氧化应激、固有免疫活化等导致肝细胞的死亡、肝脏的损伤[3]。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT),是哺乳动物细胞中一个重要的辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,又称辅酶Ⅰ)的合成限速酶。近年的研究表明,NAD参与了一系列重要生命活动,包括:炎症[4]、胰岛素抵抗[5]、肥胖[6]和血脂调节[7]。因为已知炎症、胰岛素抵抗、肥胖和血脂异常在NAFLD的发生发展中起到重要的作用,而NAMPT又是这些因素的重要调节因子。所以本课题的研究目的利用课题组前期构建的酶失活突变体NAMPT转基因小鼠(Dominant-Negative NAMPT transgenic,简称DN-NAMPT小鼠)探讨在肝脏组织NAMPT酶活性下调时对NAFLD发生的作用和机制,为NAFLD的治疗提供一些可靠的实验证据和依据。研究内容本研究首先通过免疫印记(Western Blotting)检测了NAMPT在肝脏中的表达情况,然后检测了在高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂食12周诱导的NAFLD模型小鼠的肝脏组织和血清NAMPT的表达情况。然后分别探讨了DN-NAMPT小鼠在标准饮食和高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂食(NAFLD模型)的病理变化,检测了血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT),用HE、油红O、TUNEL染色观察了肝脏组织的病理学变化,通过肝脏组织匀浆测定了肝脏甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量以及SOD、MDA氧化应激的指标,利用实时定量荧光PCR(Real-time PCR)检测了甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)转运相关基因m RNA的表达,免疫组织化学(Immunohistochemistry)检测了组织巨噬细胞的侵润和TNF-α、IL-6等炎症分子的表达。在研究得到肯定的结果后,又通过免疫印记(Western Blotting)、实时定量荧光PCR(Real-time PCR)、Masson染色和免疫组织化学测定了DN-NAMPT小鼠NAFLD模型肝组织的纤维化程度,并用免疫印记初步探讨了NAMPT与NLRP3炎症小体之间的关系。实验结果1.免疫印记结果表明NAMPT在肝脏组织的相对表达量很高,且在高脂饲料(HFD)诱导的NAFLD模型中,NAMPT在肝脏中有表达下调的趋势。与之对应NAFLD小鼠肝脏NAD水平也有明显的下调。2.在DN-NAMPT转基因小鼠上,DN-NAMPT可能通过竞争性结合底物干扰内源性NAMPT的表达和活性,导致DN-NAMPT小鼠肝脏组织的NAMPT与NAD的表达水平均下调。3.在给予标准饲料喂食时,可以看到与WT小鼠相比DN-NAMPT小鼠的肝指数增大,AST和ALT也有一定的升高,这提示我们DN-NAMPT小鼠出现了一定的肝损伤。同时,DN-NAMPT小鼠血脂有轻微下降趋势,而肝脏的脂质蓄积明显增加,油红O染色也发现肝细胞内有脂滴出现。在用Real-time PCR检测了甘油三酯和总胆固醇转运相关基因m RNA后发现,肝内与甘油三酯和总胆固醇外排的相关基因MTTP、ABCG1、ABCG5、ABCG8和LDL-R表达下调。ITT与GTT实验显示,DN-MNAMPT小鼠出现了轻微的胰岛素抵抗。通过F4/80、TNF-α的免疫组织化学表明DN-NAMPT小鼠肝脏出现明显的巨噬细胞浸润和炎症反应,而IL-6的免疫组织化学却无差异。两组小鼠均未出现肝纤维化。4.在HFD诱导的NAFLD模型中,DN-NAMPT和WT小鼠的HE与油红O染色显示肝细胞内均有大量脂滴出现,两种小鼠血脂没有明显差异,而DN-NAMPT小鼠肝脏的脂质蓄积依旧明显增加。DN-NAMPT小鼠肝脏的MDA水平增大,而SOD出现下调。TNF-α的免疫组织化学发现两种小鼠肝脏均出现了巨噬细胞浸润和炎症反应。但是,DN-NAMPT小鼠的肝组织的炎症水平(包括通过TNF-α的免疫组化染色、,NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β的免疫印记)及凋亡(TUNEL staining)更为严重。通过Masson染色、α-SMA的免疫印记以及TGF-β、TIMP1、Pro-Col1α1的Real-time PCR等检测,我们发现DN-NAMPT小鼠肝脏的纤维化病变也比WT小鼠要更加严重。结论1.在正常饮食下,肝脏NAMPT的下调可促进脂质蓄积于肝脏,使得肝脏发生轻度的脂肪变性并轻度损害肝脏功能。2.在高脂饮食下,肝脏NAMPT的下调可进一步损害肝脏功能,促进肝脏纤维化和炎症的发生。