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绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨(Dryopteris crassirhizoma Nakai)的干燥根茎及叶柄残基,又名东北贯众,味苦,性微寒,归胃、胆经,有小毒,具有杀菌除虫、清热解毒、杀菌驱虫等功效。临床上主要用于治疗流感病毒、原虫真菌感染等疾病。目前绵马贯众的研究主要集中在抗疟、抗肿瘤等方向,而在抑制真菌、细菌上研究的较少,尤其是对临床常见皮肤癣菌的抑制作用研究较少。本实验室前期研究发现,民间药香鳞毛蕨中的间苯三酚类化合物有较好的抑菌作用[60],绵马贯众与香鳞毛蕨是同科同属的植物,富含间苯三酚类化合物。因此本文拟对绵马贯众中的间苯三酚类化合物富集工艺进行优化,对总间苯三酚类化合物和各流份进行抑菌作用的筛选,对筛选的有效的流份进行化学成分的分离,并对得到的化学成分进行真菌和细菌的抑制作用研究。主要研究内容:1、绵马贯众间苯三酚化合物的富集:采用正交的方法,以总间苯三酚含量为指标,筛选总间苯三酚类化合物的提取、纯化工艺。2、采用M38-A2微量稀释法,对总提物及各流份进行抑菌作用筛选。筛选其对红色毛癣菌、犬小孢子菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌4种真菌,金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠埃希菌4种细菌的抑菌活性,测定最小抑菌浓度(MIC)。3、采用硅胶、凝胶柱色谱法,半制备液相,重结晶等方法对上述筛选的有效流份进行化学成分的分离,根据单体化合物的理化性质、波谱数据、显色反应等,解析出化合物结构式。4、采用M38-A2微量稀释法,对分离得到的化合物进行抑菌作用的筛选。筛选其对红色毛癣菌、犬小孢子菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌4种真菌,金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠埃希菌4种细菌的抑菌活性,测定最小抑菌浓度(MIC)。主要研究结果:1、最佳富集工艺为:采用料液比1:15,提取3次,每次24h,浸提。浓缩比例1:8,p H为2.5酸化沉淀。2、总提物及各流份的抑菌活性顺序为:总提物>B1>D2>D1>F>C>B2>A,G、H基本无效。3、从有效流份中分离得到10个间苯三酚类化合物,通过理化性质、显色以及波谱数据分析,鉴定出10个间苯三酚类化合物。分别为:1-(2,4,6-Thihydroxyphenyl)Butan-1-one(Y1),1-(2,4,6-Thihydroxy phenyl-3-methyl)Butan-1-one(Y2),1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy phenyl-5-methyl)Butan-1-one(Y3),1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy-phenyl)-1-Butanone(Y4),Flavaspidic acid AA(黄绵马酸AA)(Y7),Flavaspidic acid PB(黄绵马酸PB)(Y5),Norflavaspidic acid AB(Y6),Filixic acid ABA(绵马酸ABA)(Y8),Flavaspidic acid AB(黄绵马酸AB)(Y9),Filixic acid ABP(绵马酸ABP)(Y10)。其中化合物1-(2,4,6-Thihydroxyphenyl)Butan-1-one,1-(2,4,6-Thihydroxy phenyl-3-methyl)Butan-1-one,1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy phenyl-5-methyl)Butan-1-one,1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy-phenyl)-1-Butanone为首次从绵马贯众中得到。4、通过M38-A2方法,对上述10个间苯三酚类化合物进行抑菌试验。结果显示,抑制红色毛癣菌活性大小顺序为:Filixic acid ABA>Flavaspidic acid PB、Norflavaspidic acid AB,其余无效。抑制须癣毛癣菌活性大小顺序为:Filixic acid ABA>Norflavaspidic acid AB、Flavaspidic acid AA,其余无效。抑制石膏样小孢子菌活性大小顺序为:Filixic acid ABA>Flavaspidic acid AA>1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy-phenyl)-1-Butanone,其余无效。抑制犬小孢子菌活性大小顺序为:Filixic acid ABA>Norflavaspidic acid AB、1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy phenyl-5-methyl)Butan-1-one>Flavaspidic acid AA>Flavaspidic acid PB>Flavaspidic acid AB,其余无效。抑制金黄色葡萄球菌活性大小顺序为:Filixic acid ABA>Norflavaspidic acid AB、Filixic acid ABP>Flavaspidic acid PB>1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy phenyl-5-methyl)Butan-1-one、1-(2,4,6-Thihydroxy phenyl-3-methyl)Butan-1-one>Flavaspidic acid AB,其余无效。抑制表皮葡萄球菌活性大小顺序为:Filixic acid ABA>Filixic acid ABP>1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy phenyl-5-methyl)Butan-1-one、Norflavaspidic acid AB>1-(3-Acetyl-2,4,6-thihydroxy-phenyl)-1-Butanone、Flavaspidic acid AA、1-(2,4,6-Thihydroxy phenyl-3-methyl)Butan-1-one,其余无效。分离得到的化合物对于大肠埃希菌和绿脓杆菌无效。其中,Filixic acid ABA抑制真菌的作用较好,抑制红色毛癣菌的MIC为40μg/m L,抑制须癣毛癣菌的MIC为20μg/m L,抑制石膏样小孢子菌的MIC为40μg/m L,抑制犬小孢子菌的MIC为10μg/m L。Filixic acid ABP和Filixic acid ABA抑制细菌的作用较好。Filixic acid ABP抑制金黄色葡萄球菌的MIC为20μg/m L,抑制表皮葡萄球菌的MIC为20μg/m L。Filixic acid ABA抑制金黄色葡萄球菌的MIC为2.5μg/m L,抑制表皮葡萄球菌的MIC为2.5μg/m L。阳性药头孢西丁抑制金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/m L,阳性药头孢西丁抑制表皮葡萄球菌的MIC为16μg/m L。Filixic acid ABA抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的效果与阳性药相当。结论:优化了绵马贯众中总间苯三酚类化合物的富集工艺。从有效流份中分离得到10个间苯三酚类化合物,其中有4个是在绵马贯众中首次分离得到。Filixic acid ABA抑制真菌、细菌作用较好,可为后续进一步开发新药奠定基础。