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研究背景随着生活水平的提高，不良的饮食和生活习惯盛行，使得糖尿病的发病率迅速提高，已成为当前威胁人类健康的最重要疾病之一。糖尿病的主要损害主要在于其引起的各种器官并发症，其中以心血管并发症的危害最重，是糖尿病患者死亡的主要原因。与非糖尿病正常心脏相比，糖尿病患者心脏更易受缺血性损伤，且损伤明显加重，梗塞面积加大、心律失常增加。许多研究证实心肌细胞凋亡可能参与其中。考虑到心肌细胞是一种终末分化细胞，没有再生增殖能力，长期慢性的凋亡使其数量逐渐减少会导致心脏泵功能降低直至心力衰竭。当前的许多研究致力于阐明糖尿病引起心肌细胞凋亡的机制，并寻找能抑制糖尿病心肌细胞凋亡的方法和药物，进而控制糖尿病的发展和各种并发症的发生。硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）系统是广泛表达于机体各种细胞的一个重要的抗自由基系统，在很多涉及自由基损伤和凋亡的疾病的发生发展中起着重要的作用。我实验室前期用高糖高脂诱导结合STZ注射制成2型糖尿病大鼠在体模型和高糖高脂刺激培养的成年大鼠心肌细胞以及H9C2心肌细胞离体模型上都观察到明显的心肌细胞凋亡发生。同时观察到Trx硝基化、TR活性降低、TXNIP表达上调，伴随糖尿病时Trx活性下降。。白藜芦醇（Resveratrol，RSV）多酚类化合物，是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物，由于其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、心血管保护，甚至抗衰老作用而受到极大的关注。近年来研究证实，白藜芦醇具有一定的对抗糖尿病作用。白藜芦醇可改善糖尿病诱导的肝脏、胰腺以及肾脏损伤，减少胰岛细胞凋亡并改善胰岛素抵抗。【1】但目前对白藜芦醇在糖尿病引起心肌细胞凋亡中的作用及其机制，以及在此过程中白藜芦醇对Trx系统的影响的还缺乏研究。目的以高糖刺激的乳鼠心肌细胞模拟糖尿病诱导心肌细胞损伤，给予白藜芦醇预处理观察对心肌细胞凋亡的影响，及其对硫氧还蛋白系统的影响。材料与方法1.乳鼠心肌细胞的分离与培养以及实验分组将培养48h的乳鼠心肌细胞分为三组：1）正常对照组：使用含葡萄糖5.5mmol/L的DMEM培养基加入甘露醇20mmol/L作为对照培养基进行培养；2）高糖组：使用含葡萄糖25mmol/L的DMEM培养基作为高糖培养基进行培养；3）高糖+白藜芦醇组：使用含葡萄糖25mmol/L的DMEM培养基加入终浓度30μmol/L的白藜芦醇对细胞进行45min预处理后换25mmol/L高糖培养基继续培养，各组细胞均继续培养48h后收集细胞及培养基上清进行指标测定。2.指标检测测定培养基上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性反映心肌细胞损伤情况，以标记了FITC的AnnexinV作为荧光探针利用流式细胞仪检测细胞凋亡程度，以胰岛素还原法测定心肌细胞中Trx活性，使用ELISA对细胞内3-硝基酪氨酸（3-NT)生成进行测定，以Real-timePCR法测定心肌细胞TXNIP的mRNA水平，以WesternBlot法测定心肌细胞Trx1和TXNIP的蛋白表达，以DCFH-DA作为荧光探针使用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平，硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛（MDA）含量以反映脂质氧化水平。结果1.乳鼠心肌细胞培养48h后形态学观察接种48h后细胞形成细胞簇或细胞单层，贴壁细胞呈梭形、多角形，通过周边突起的伪足相互交联，铺满瓶底，呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长，细胞搏动逐渐同步，收缩有力，于72h达高峰。2.乳酸脱氢酶（LDH）活性测定经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞的乳酸脱氢酶活性增高（1.978±0.609vs1±0.321,P<0.05），提示高糖可引起心肌细胞损伤；而白藜芦醇预处理组，乳酸脱氢酶活性下降（1.105±0.305vs1.978±0.609,P<0.05），表明白藜芦醇预处理能明显减轻高糖对细胞的损伤。3．流式细胞仪检测心肌细胞凋亡结果显示，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞凋亡明显增加(24.075±5.052vs9.993±1.971,P<0.05），给予白藜芦醇预处理后凋亡减少(10.104±1.483vs24.075±5.052,P<0.05)，表明白藜芦醇对高糖诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。4．Trx活性分析经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞Trx活性显著降低(0.41±0.032vs1±0.025,P<0.05)，给予白藜芦醇预处理后高糖引起的Trx活性下降明显得以改善(1.23±0.133vs0.41±0.032,P<0.05)。5．Trx相对表达结果显示，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组和白藜芦醇预处理组乳鼠心肌细胞Trx1蛋白表达均未见明显变化(1.001±0.018,0.832±0.03vs1±0.023,P>0.1)。6.TXNIP相对表达经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞TXNIP表达明显增高(1.41±0.08vs1±0.125,P<0.05),给予白藜芦醇预处理逆转了由高糖引起的TXNIP表达的改变(0.987±0.163vs1.41±0.08,P<0.05)。7.TXNIPmRNA表达经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞在培养48h后，TXNIPmRNA水平显著增加(12.873±1.726vs1.00±0.00,P<0.05)，给予白藜芦醇预处理后TXNIPmRNA水平明显降低(8.406±0.811vs12.873±1.726,P<0.05)。该结果提示，给予白藜芦醇预处理能有效逆转由高糖引起的心肌细胞TXNIPmRNA水平的增加。8．3-硝基酪氨酸含量测定经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞内3-硝基酪氨酸含量升高(16.978±0.20vs7.876±1.574,P<0.05)，给予白藜芦醇预处理后3-硝基酪氨酸含量降低(12.041±0.429vs16.978±0.20,P<0.05)。9．p38激酶活性分析结果显示，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞p38激酶活性增高(1.437±0.09vs1±0.157,P<0.05)，给予白藜芦醇预处理后p38激酶活性降低(0.84±0.094vs1.437±0.09,P<0.05)。10.活性氧（ROS）生成测定经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞在培养48h后，细胞内活性氧生成显著增加(1.59±0.141vs1±0.179,P<0.05)，给予白藜芦醇预处理后活性氧生成量降低(0.61±0.08vs1.59±0.141,P<0.05)。该结果提示，给予白藜芦醇预处理能明显减少由高糖引起的心肌细胞内活性氧生成.11．丙二醛（MDA）测定经检测，与正常对照组心肌细胞相比，高糖组乳鼠心肌细胞在培养48h后，细胞内MDA水平显著增加(9.13±1.16vs5.83±0.178,P<0.05)，给予白藜芦醇预处理后MDA水平明显降低(4.06±0.38vs9.13±1.16,P<0.05)。该结果提示，给予白藜芦醇预处理能有效减轻高糖诱导的脂质过氧化损伤。结论1.高糖可引起培养的乳鼠心肌细胞发生损伤和凋亡，伴随自由基产生、脂质氧化损伤和Trx系统改变，Trx活性降低、TXNIP表达上调。2.白藜芦醇预处理可使Trx活性得到改善，高糖引起的TXNIP的表达明显下调，细胞内活性氧生成、MDA含量、3-硝基酪氨酸生成量明显降低。通过对Trx系统的保护，而减轻高糖引起的细胞损伤和凋亡。