第一部分 内源性胆固醇在BMSCs成骨分化中的作用及机制目的:研究内源性胆固醇在骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化中的作用;明确Hedgehog(Hh)信号通路在此过程中发挥的调控机制。方法:采用“体外细胞内胆固醇去除试验”去除BMSCs(包括ST2细胞和原代BMSCs)的内源性胆固醇:饥饿处理BMSCs 24小时,使用含1.5%环糊精的α-MEM完全培养基去除细胞内胆固醇,细胞孵育半小时,使用含40uM普伐他汀钠的α-MEM完全培养基阻断细胞内胆固醇的生物合成。使用“细胞内胆固醇荧光染色”法,分别在荧光显微镜放大4倍、10倍、20倍时检测ST2细胞内源性胆固醇的荧光量。同时,光学显微镜放大相同倍数观察去除内源性胆固醇前后ST2细胞的密度变化。向含有去除内源性胆固醇的ST2细胞和原代BMSCs的α-MEM完全培养基内加入5%Shh上清,以293T上清为对照。3天后使用ALP染色法检测ST2细胞和原代BMSCs的ALP染色阳性程度,使用实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测Hh信号通路靶基因(Glil,Ptch1)的表达水平,7天后使用qPCR法检测原代BMSCs成骨相关基因(Alpl、Sp7、Ibsp、Runx2和Ocn)的表达水平。此外,向含有去除内源性胆固醇的ST2细胞的α-MEM完全培养基内加入2uM Purmorphamine(Purmo),以二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)为对照。3天后使用ALP染色及定量法检测ST2细胞ALP染色阳性程度及其活性,使用qPCR法检测成骨相关基因(Alp1)及Hh信号通路靶基因(Glil,Ptch1)的表达水平。结果:去除ST2细胞的内源性胆固醇后,在荧光显微镜放大4倍、10倍、20倍时其相对总细胞的荧光量均明显下降,ST2细胞的内源性胆固醇去除率为72%,此时ST2细胞的密度未见明显变化。去除内源性胆固醇+Shh上清组的原代BMSCs和ST2细胞ALP染色阳性程度、Hh信号通路靶基因(Gli1,Ptch1)和原代BMSCs成骨相关基因(Alp1、Sp7、Ibsp、Runx2和Ocn)的表达水平均显著降低。去除内源性胆固醇+Purmo组的ST2细胞ALP染色阳性程度及其活性、成骨相关基因(Alp1)的表达水平均显著降低,而Hh信号通路靶基因(Gli1,Ptchl)的表达水平未见明显变化。结论:内源性胆固醇通过依赖或独立于Hh信号通路的分子机制是BMSCs成骨分化所必需的物质。因此,生理水平的内源性胆固醇能够调控Hh信号通路并维持成骨分化,盲目降低内源性胆固醇是不科学的,这为OP的防治提供了理论基础及临床指导:维持生理水平的内源性胆固醇对OP的发生可能起预防作用。第二部分 外源性胆固醇分别在基础成骨诱导液和Wnt诱导剂中抑制BMSCs的成骨分化及机制目的:研究外源性胆固醇分别在基础成骨诱导液和Wnt诱导剂中对BMSCs成骨分化的作用;明确Hh和Wnt信号通路在此过程中发挥的调控机制。方法:首先向含有α-MEM完全培养基的ST2细胞内分别加入5%Shh上清和2uM Purmo,分别以293T上清和DMSO为对照。3天后使用ALP染色法检测ST2细胞的ALP染色阳性程度,7天后使用qPCR法检测ST2细胞Hh信号通路靶基因(Gli1,Ptch1)、成骨相关基因(Alp1、Sp7和Ibsp)的表达水平,14天后使用Von Kossa染色法检测ST2细胞的基质矿化能力。其次,向含有α-MEM完全培养基的ST2细胞内分别加入不同浓度的外源性胆固醇,观察Hh信号通路的激活情况及胆固醇的最大不析出浓度。向含有20ug/ml外源性胆固醇的ST2细胞中分别加入Cyclopamine(Smo蛋白的抑制剂)或Gant61(Glil转录因子的抑制剂),检测外源性胆固醇激活Hh信号通路的作用位点。分别向含有α-MEM完全培养基的ST2细胞、含有基础成骨诱导液的ST2细胞和原代BMSCs内加入20ug/ml外源性胆固醇,2天后使用qPCR法检测成骨相关基因(Alp1、Sp7、Ibsp、Runx2、Ocn和Col1)及Hh信号通路靶基因(Gli1)的表达水平。7天和14天后使用ALP染色法检测ST2细胞和原代BMSCs的ALP染色阳性程度,使用qPCR法检测ST2细胞和原代BMSCs的成骨相关基因(Alp1、Sp7、Ibsp、Runx2和Col1)及Hh信号通路靶基因(Gli1)的表达水平,使用免疫印迹实验(Western Blot,WB)检测ST2细胞成骨相关蛋白(Runx2、Osterix)的表达量。此时,向含有α-MEM完全培养基的ST2细胞中加入20ug/ml外源性胆固醇,分别于6h、12h、24h、48h、72h检测ST2细胞的增殖情况。最后,向含有20%Wnt3a上清的α-MEM完全培养基中加入胆固醇,3天后使用ALP染色及定量法检测ST2细胞的ALP染色阳性程度及活性,使用qPCR法检测成骨相关基因(Alp1和Ibsp)、Wnt信号通路靶基因(Axin2和Nkd2)及Hh信号通路靶基因(Gli1和Ptch1)的表达水平。结果:Shh上清组和Purmo组ST2细胞的Hh信号通路靶基因(Gli1,Ptch1)的表达量、ALP和Von Kossa染色阳性程度、成骨相关基因(Alp1、Sp7和Ibsp)的表达水平均明显增高。随着胆固醇度的不断增加,Hh信号通路靶基因(Glil)的表达水平逐渐增加,其中胆固醇的最大不析出浓度为20ug/ml。随着Cyclopamine或Gant61浓度的增加,胆固醇升高Glil基因的表达水平不断降低。经外源性胆固醇处理后,ST2细胞的ALP染色阳性程度、成骨相关基因(Alp1、Sp7、Ibsp、Runx2、Ocn和Col1)、成骨相关蛋白(Runx2、Osterix)的表达水平均显著降低,而Hh信号通路靶基因(Gli1)的表达水平明显升高;原代BMSCs的ALP染色阳性程度、成骨相关基因(Alp1、Sp7、Ibsp、Runx2和Col1)的表达水平均明显下降,而Hh信号通路靶基因(Gli1和Ptch1)的表达水平未见明显变化。同时6h、12h、24h、48h、72h时ST2细胞均处于轻度增殖状态。经Wnt3a上清和外源性胆固醇同时处理后,ST2细胞的ALP染色阳性程度及其活浓性、成骨相关基因(Alp1和Ibsp)的表达水平明显降低,而Wnt信号通路靶基因(Axin2和Nkd2)的表达水平显著升高,同时Hh信号通路靶基因Gli1的表达水平明显升高,而Ptch1基因未见明显变化。结论:外源性胆固醇可能通过作用于Hh信号通路中的Smo蛋白或其上游调控因子激活Hh信号通路。虽然外源性胆固醇不能激活Wnt信号通路,但是,能够提高已激活的Wnt信号通路的活跃程度。外源性胆固醇通过独立于Hh和Wnt信号通路的分子机制抑制BMSCs的成骨分化。这为OP的防治提供了理论基础及临床指导:过量的外源性胆固醇可能导致OP的发生。第三部分 外源性胆固醇在Hh诱导剂中、羟基胆固醇在普通培养基中调控BMSCs的成骨分化及机制目的:研究外源性胆固醇在Hh诱导剂中对BMSCs成骨分化的作用及其分子机制。初步研究羟基胆固醇在其他BMSCs细胞系中对成骨分化的作用及Hh信号通路在此过程中发挥的调控机制。方法:首先分别向含有ST2细胞的α-MEM完全培养基内加入Hh信号通路的诱导剂:2uM Purmo和5%Shh上清。在此基础上,分别加入20ug/ml外源性胆固醇,15h后使用qPCR法检测ST2细胞的Hh信号通路靶基因(Glil)的表达水平,3天后使用ALP染色及定量法检测ST2细胞的ALP染色阳性程度及其活性,分别在3天、7天、14天使用qPCR法检测ST2细胞的成骨相关基因(Alp1、Sp7和Ibsp)及Hh信号通路靶基因(Glil和Ptch1)的表达水平,14天后使用Von Kossa染色法检测ST2细胞的基质矿化能力。其次,分别向含有ST2细胞的α-MEM完全培养基内加入10uM的22(S)-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇,分别在15h、7天使用qPCR法检测Hh信号通路靶基因(Gli1)的表达水平。最后,分别向含有ST2细胞的α-MEM完全培养基内加入不同浓度(5uM和10uM)的22(S)-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇,3天后使用ALP染色法检测ST2细胞的ALP染色阳性程度。结果:经Purmo或Shh上清处理后,ST2细胞的ALP和Von Kossa染色阳性程度、ALP活性、成骨相关基因(Alp1、Sp7和Ibsp)、Hh信号通路靶基因(Gli1和Ptch1)的表达水平均明显升高。在此基础上,又经外源性胆固醇处理后,ST2细胞的ALP和Von Kossa染色阳性程度、ALP活性、成骨相关基因(Alp1、Sp7和Ibsp)的表达水平均显著降低,Hh信号通路靶基因(Glil和Ptch1)的表达水平也显著降低。经22(S)-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇处理后,ST2细胞的Hh信号通路靶基因(Gli1)均明显升高。经不同浓度的22(S)-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇处理后,ST2细胞的ALP染色阳性程度升高。结论:外源性胆固醇能够降低已激活的Hh信号通路的活跃程度并抑制ST2细胞的成骨分化。外源性胆固醇及其氧化物(羟基胆固醇)均能够通过依赖Hh信号通路的分子机制,分别发挥抑制或促进成骨分化的不同作用。羟基胆固醇能够在多种BMSCs细胞系中发挥促进成骨分化的作用,初步为OP的防治提供理论基础及临床指导:羟基胆固醇有望成为骨形成促进剂治疗OP。