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目的:1.以代谢组学为基础,筛选纳米氧化镍(nickel oxide,NiO)染毒后大鼠血清中差异代谢产物及其代谢通路,初步探讨纳米NiO导致胆汁酸代谢紊乱的潜在机制。2.建立纳米NiO染毒大鼠肝纤维化模型和纳米NiO致人肝癌细胞(HepG2)胶原过量形成模型,探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的Smad信号通路、上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)/金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitors of metalloproteinases 1,TIMP1)失衡在纳米NiO致大鼠肝纤维化中的作用。方法:1.(1)选择32只健康成年雄性Wistar大鼠(180~220 g),随机分为对照组(生理盐水)、0.015 mg/kg、0.06 mg/kg和0.24 mg/kg纳米NiO组,每周气管滴注染毒2次,持续9周。染毒结束后心脏采血,分离血清,并摘取肝脏保存。(1)选择对照组和0.24 mg/kg纳米NiO组大鼠血清,用液相色谱和质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC/MS)鉴定血清代谢产物,并筛选差异代谢产物及其潜在的代谢通路。(2)采用石墨炉原子吸收分光光度法检测肝组织中镍含量。用Western blot分析肝组织中胆汁酸代谢相关蛋白,包括胆固醇7-α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、甾醇12α-羟化酶(sterol 12α-hydroxylase,CYP8B1)、多耐药蛋白2(multidrug resistance associated protein 2,MRP2)、MRP3、MRP4、胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)、细胞色素P450 3A4(cytochrome P450 3A4,CYP3A4)、脱氢表雄酮硫酸转移酶(sulfotransferase 2A1,SULT2A1)的表达水平。2.(1)体内实验:常规制备肝组织Masson染色切片并观察肝纤维化发生情况。采用Western blot检测肝组织胶原I(type I collagen,Col-I)、Col-III、TGF-β1、E-钙黏素(E-cadherin)、α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、MMP9和TIMP1的蛋白表达水平。(2)体外实验:选择对数生长期的HepG2细胞,分别用不同浓度的纳米NiO(0、12.5、25、50、100和200μg/mL)处理细胞24h,后续选择100μg/mL纳米NiO和TGF-β1抑制剂SB431542联合处理HepG2细胞24小时。采用MTT法检测纳米NiO对HepG2细胞增殖的影响,生化试剂盒检测纳米NiO处理后细胞培养液中羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量。采用Western blot检测HepG2细胞Col-I、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、MMP9和TIMP1的蛋白表达水平。结果:1.根据LC/MS数据绘制主成分分析(principal components analysis,PCA)和偏-最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)图,结果显示对照组和纳米NiO组大鼠血清样品呈明显分离现象。与对照组比较,纳米NiO染毒组大鼠血清中发现21种差异代谢产物(P<0.05),涉及胆汁酸(bile acids,BAs)、脂质、脂肪酸和磷脂代谢。纳米NiO染毒组大鼠血清胆汁酸主要成分胆酸(cholic acid,CA)和脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)含量降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。纳米NiO染毒组大鼠肝组织中镍含量明显高于对照组(P<0.05)。大鼠肝组织Western blot检测发现,纳米NiO染毒组大鼠肝组织胆汁酸关键合成酶CYP7A1蛋白表达下调,而转运蛋白BSEP以及解毒酶CYP3A4和SULT2A1蛋白表达均上调,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2.(1)体内实验:肝组织Masson染色结果显示,纳米NiO高剂量组肝组织汇管区胶原沉积明显增多。与对照组比较,纳米NiO组大鼠肝组织Col-I、Col-III、TGF-β1、α-SMA、MMP9和TIMP1的蛋白水平以及Smad2/3的磷酸化水平均升高,而E-cadherin和Smad7的蛋白表达水平均降低(P<0.05),以0.24 mg/kg纳米NiO组尤为显著;但ERK1/2、p-ERK1/2、p38和p-p38蛋白表达水平均未见明显改变(P>0.05)。(2)体外实验:MTT法检测结果显示,随着纳米NiO处理浓度的升高(0~200μg/mL),HepG2细胞存活率呈剂量依赖性降低趋势(99.33%~65.6%),其中25、50、100和200μg/mL组细胞存活率均低于对照组(P<0.05)。100μg/mL纳米NiO组HepG2细胞培养液中Hyp含量上升,同时细胞中Col-I、α-SMA、TGF-β1、TIMP1、MMP9的蛋白水平及Smad2/3的磷酸化水平均升高,而E-cadherin和Smad7的蛋白水平均降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。根据以上结果,本研究选择100μg/mL纳米NiO联合TGF-β1抑制剂SB431542处理HepG2细胞,探讨纳米NiO诱导HepG2细胞胶原过量形成的可能机制。结果发现,纳米NiO组HepG2细胞中Col-I、α-SMA、TIMP1、MMP9的蛋白水平和Smad2/3的磷酸化水平均高于对照组,而Smad7和E-cadherin的蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。与纳米NiO组比较,SB431542+纳米NiO组HepG2细胞中Col-I、α-SMA、TIMP1、MMP9的蛋白含量和Smad2/3的磷酸化水平均降低,而Smad7和E-cadherin的蛋白水平均升高(P<0.05)。结论:1.纳米NiO可引起大鼠胆汁酸、脂质、脂肪酸和磷脂代谢通路的紊乱,其中胆汁酸代谢紊乱可能与胆汁酸合成酶CYP7A1蛋白表达下调、转运蛋白BSEP以及解毒酶CYP3A4和SULT2A1蛋白过表达有关。2.纳米NiO通过TGF-β1介导Smad信号通路的激活、EMT发生和MMP9/TIMP1失衡而致大鼠肝纤维化发生。