【摘 要】
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茄子(Solanum melongna L.)系茄科茄属一年生植物,营养丰富,作为我国夏秋季节主要菜蔬之一,在全国各地广泛种植。茄子生长的各个阶段都会受到环境因素的影响,其中,土壤盐渍化对茄子产量和品质造成恶劣影响。WRKY转录因子家族在植物逆境响应方面具有重要作用,在植物响应盐胁迫方面已有诸多研究。利用植物基因工程,将具有耐盐功能的转录因子导入茄子,进而获得茄子新品种,为茄子种质创新和分子改良提
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茄子(Solanum melongna L.)系茄科茄属一年生植物,营养丰富,作为我国夏秋季节主要菜蔬之一,在全国各地广泛种植。茄子生长的各个阶段都会受到环境因素的影响,其中,土壤盐渍化对茄子产量和品质造成恶劣影响。WRKY转录因子家族在植物逆境响应方面具有重要作用,在植物响应盐胁迫方面已有诸多研究。利用植物基因工程,将具有耐盐功能的转录因子导入茄子,进而获得茄子新品种,为茄子种质创新和分子改良提供了新思路。而茄子木质化程度高,利用常规的遗传转化方法获得转基因植株较为困难。在本研究中,我们通过同源比对获得茄子SmWRKY40基因,并建立起农杆菌介导的茄子遗传转化体系,将SmWRKY40基因分别在拟南芥和茄子中过表达后,初步验证该基因在盐胁迫下的功能。研究主要结果如下:1.运用多个生物信息学网站和软件对茄子SmWRKY40转录因子进行分析,结果显示,SmWRKY40最大开放阅读框(ORF)有1020 bp,编码339个氨基酸,对其保守结构域进行预测,发现SmWRKY40蛋白属于WRKY转录因子GroupⅡ亚家族;与其他物种的同源序列进行比对并构建系统进化树发现,SmWRKY40在进化上与野生番茄(Solanum chilense)中Sc WRKY40亲缘关系较近;SmWRKY40蛋白的理论分子量为37641.80 k D,不稳定系数(Ⅱ)为45.17;理论等电点(theoretical p I)为8.84,为弱酸性亲水蛋白,最可能定位在细胞核上;对SmWRKY40基因启动子区域预测分析,发现上游2 kb区域中含有3个脱落酸响应元件(ABA Response element,ABRE);酵母单杂实验表明,SmWRKY40具有转录激活活性;实时荧光定量实验结果显示,SmWRKY40基因在茄子成熟根中特异性表达,且受非生物胁迫(干旱、盐、高温胁迫)和ABA不同程度的诱导,其中盐胁迫对SmWRKY40基因诱导最显著。2.构建植物过表达载体p Cambia2301-ky-SmWRKY40,并对农杆菌介导的茄子遗传转化过程中各个步骤进行探索,筛选出茄子遗传转化最佳的外植体材料和部位、用于筛选非转化外植体的卡那霉素(Kan)浓度、抑菌抗生素特美汀(Tim)浓度,研究遗传转化过程中各个步骤对外植体转化效率的影响。分析结果显示:茄子品种‘卜丽卡’的下胚轴是用于茄子遗传转化的最佳外植体材料,75 mg/L Kan能够有效筛选出茄子抗性芽,200 mg/L Tim能够有效抑制农杆菌的再生,保护外植体不被污染;预培养3 d后的外植体分化效果最好,此时抗性出愈率为65.0%,抗性出芽率最高,为15.0%。菌液OD600为0.8,侵染15 min,可达最佳转化效果。经DNA水平上的检验初步证明,有22株茄子为SmWRKY40阳性苗,在此基础上进一步对阳性苗进行q RT-PCR试验,检测SmWRKY40基因的表达情况。3.将SmWRKY40过表达载体异源转化拟南芥Col-0,发现在Na Cl、甘露醇和ABA处理下,拟南芥OE株系的种子萌发率、根伸长情况明显优于野生型。用盐水处理拟南芥植株发现,过表达植株受Na Cl伤害情况比野生型植株更轻,生长状态明显好于野生型。盐胁迫下,过表达植株中ROS和MDA含量比野生型植株中积累的更少,表明SmWRKY40的过表达使拟南芥受到的氧化伤害更小。而抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性和渗透调节物质(可溶性蛋白和脯氨酸)含量则相反。对茄子SmWRKY40过表达植株和野生型植株进行盐处理,发现茄子SmWRKY40过表达材料比茄子野生型材料受到的伤害更轻,且叶绿素含量更高。综上表明,SmWRKY40在茄子耐盐中起到正调控作用。
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