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蛋白质相互作用伴随着生命活动的整个过程,是任何生命体结构和生命活动的基础。研究蛋白的相互作用有助于蛋白质功能的分析、相互作用网络的构建以及药物的开发等问题的解决。人们通常采用免疫共沉淀法、表面等离子体共振法以及荧光共振能量转移等方法研究蛋白的相互作用,然而这些方法通常在体外进行试验,需要对蛋白质进行提取、纯化等繁琐步骤,在一定程度上影响了蛋白的正常生理状态,不能反映蛋白的真实情况。近年来随着生物技术的发展,酵母双杂交系统得到了广大研究者的青睐,该系统采用分子生物学的方法将所需研究的蛋白质基因片段构建到相应的质粒中,蛋白质在细胞内表达,通过相互作用激发报告基因的转录表达,进而通过分析报告基因来判断蛋白的相互作用。然而该方法存在试验周期长、假阳性率高等缺点。在此基础上,人们开发了一种基于腺苷酸环化酶重构的细菌双杂交(Bacterial adenylate cyclase-based two hybrid,BACTH)系统,该系统与酵母双杂交系统相比具有不需要所研究的蛋白定位于细胞核、实验周期短、假阳性率低等优点。该系统用于研究蛋白的相互作用具有较大的优势,然而现有的检测方法,只能对蛋白的相互作用进行定性分析,无法做到定量检测,而且这些方法均是基于大量细胞的集权平均得出的检测结果,无法区分细胞之间的异质性。超高灵敏流式检测装置(High sensitivity flow cytometry,HSFCM)能在单颗粒水平上对细胞进行快速、多参数、定量的分析,结合绿色荧光蛋白(GFP)报告因子无需进行细胞膜处理,以及抗体孵育等繁琐步骤,且具有荧光稳定、无毒害、共用性和通用性强且可以直接检测等特点,本论文发展了一种基于BACTH系统,单细菌水平上高通量、快速的检测蛋白质相互作用的新方法。论文第一章为文献综述。主要对蛋白质相互作用的意义和主要研究方法进行介绍,并着重介绍了酵母双杂交系统和BACTH系统。明确了 BACTH系统研究蛋白相互作用的优势,在本章末尾介绍了超高灵敏流式检测装置及其在生化分析中的应用。论文第二章为串联表达载体的构建,为了往BACTH系统引入含有报告基因gfp的质粒pTW2,需将一对相互作用蛋白的基因构建在同一个质粒上,以与细菌外膜稳定性相关的蛋白对Pal和TolB以及TolB的两个突变体TolB Δ22-25和TolB Δ22-33 为研究对象,将pl 构建到质粒 pKT25-His-tolB、pKT25-His-tolBΔ22-25以及pKT25-His-tolB Δ22-33的XhoI酶切位点中,然后将构建好的质粒转入到报告细菌E.coli BTH101感受态细胞中,通过测定β-半乳糖苷酶酶活的方法判断相互作用蛋白对的表达。论文第三章以质粒pKT25-zip-lac-T18-zip为研究对象,将其与质粒pTW2共转到报告细菌E.coliBTH101感受态细胞中,通过Zip-Zip的相互作用,能够激发报告基因gfp的表达,结合超高灵敏流式检测装置(High sensitivity flow cytometry,HSFCM)建立了单细菌水平检测绿色荧光强度的超高灵敏分析法,GFP可以在液体培养中检测分析,且检测灵敏度很高,很大程度提高了实验的准确性,大大的降低了假阳性率。第四章主要采用第三章中建立的检测改进型BACTH系统的方法,检测不同相互作用强度的蛋白对,选择构建好的单质粒型串联表达载体pKT25-His-tolB-lac-TI8-pal 和 pKT25-His-tolB Δ22-23-lac-T18-pal,研究同一体系中不同单菌落之间的关系,以及不同相互作用强度的蛋白对之间的关系。论文第五章为总结和展望。总结了本论文的研究工作和成果,并对未来进一步的研究工作进行了展望。